A higienização das mãos é a forma mais importante de prevenção primária a infecções hospitalares que se tem dentro de um serviço de saúde e medidas simples, porém eficazes, como a utilização de água e sabão podem reduzir drasticamente o número de microrganismos que podem estar presente nas mãos de profissionais da saúde. O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade da higienização das mãos de profissionais da enfermagem. A pesquisa foi realizada com 12 profissionais que atuam nos setores UTI adulto com pacientes clínicos e UTI neonatal de um hospital da rede privada na região metropolitana do Vale do Paraíba, SP – Brasil e a avaliação se deu mediante questionamento da técnica utilizada pelos profissionais e por determinação de número de UFC de bactérias coletadas em swab das mãos, coletado antes e após procedimento de higienização. Observou-se que a maioria dos participantes (83,2%) antes e após contato com pacientes, fluidos e superfícies,  e que 91,6% usa alcool quando não consegue higienizar as mãos. Os profissionais de nível técnico apresentaram maior redução no número de UFC que os profissionais de nível superior, com diferença de 22,13% e em geral houve redução considerável no número de microrganismos. Conclui-se que o procedimento de higienização de mãos que foi preconizado pelos profissionais independentes da classe resultou eficácia, porém com algumas falhas pontuais, o que trazem à tona a não conformidade nos procedimentos de higienização das mãos sendo necessário intensificar treinamentos e capacitações através de educação continuada.