No abstract

No abstract

Reversine or 2-(4-morpholinoanilino)-N6-cyclohexyladenine was originally identified as a small organic molecule that induces dedifferentiation of lineage-committed mouse myoblasts, C2C12, and redirects them into lipocytes or osteoblasts under lineage-specific conditions (LISCs). Further, it was proven that this small molecule can induce cell cycle arrest and apoptosis and thus selectively lead cancer cells to cell death. Further studies demonstrated that reversine, and more specifically the C2 position of the purine ring, can tolerate a wide range of substitutions without activity loss. In this study, a piperazine analog of reversine, also known as aza-reversine, and a biotinylated derivative of aza-reversine were synthesized, and their potential medical applications were investigated by transforming the endoderm originates fetal lung cells (MRC-5) into the mesoderm originated osteoblasts and by differentiating mesenchymal cells into osteoblasts. Moreover, the reprogramming capacity of aza-reversine and biotinylated aza-reversine was investigated against MRC-5 cells and mesenchymal cells after the immobilization on PMMA/HEMA polymeric surfaces. The results showed that both aza-reversine and the biofunctionalized, biotinylated analog induced the reprogramming of MRC-5 cells to a more primitive, pluripotent state and can further transform them into osteoblasts under osteogenic culture conditions. These molecules also induced the differentiation of dental and adipose mesenchymal cells to osteoblasts. Thus, the possibility to load a small molecule with useful “information” for delivering that into specific cell targets opens new therapeutic personalized applications.

Protein-based carriers are promising vehicles for the intracellular delivery of therapeutics. In this study, we designed and studied adenovirus protein fiber constructs with potential applications as carriers for the delivery of protein and nanoparticle cargoes. We used as a basic structural framework the fibrous shaft segment of the adenovirus fiber protein comprising of residues 61–392, connected to the fibritin foldon trimerization motif at the C-terminal end. A fourteen-amino-acid biotinylation sequence was inserted immediately after the N-terminal, His-tagged end of the construct in order to enable the attachment of a biotin moiety in vivo. We report herein that this His-tag biotinylated construct folds into thermally and protease-stable fibrous nanorods that can be internalized into cells and are not cytotoxic. Moreover, they can bind to proteins and nanoparticles through the biotin–streptavidin interaction and mediate their delivery to cells. We demonstrate that streptavidin-conjugated gold nanoparticles can be transported into NIH3T3 fibroblast and HeLa cancer cell lines. Furthermore, two streptavidin-conjugated model proteins, alkaline phosphatase and horseradish peroxidase can be delivered into the cell cytoplasm in their enzymatically active form. This work is aimed at establishing the proof-of-principle for the rational engineering of diverse functionalities onto the initial protein structural framework and the use of adenovirus fiber-based proteins as nanorods for the delivery of nanoparticles and model proteins. These constructs could constitute a stepping stone for the development of multifunctional and modular fibrous nanorod platforms that can be tailored to applications at the sequence level.

Στα πλαίσια της προκείμενης εργασίας, συγκεκριμένες επιφάνειες υπέστησαν κατεργασία προκειμένου να καθηλωθούν τόσο κυτταρικά οργανίδια (ριβόσωμα) όσο και πρωτεΐνες (BMP2) ή ένα χημικό ανάλογο πουρινών, η ρεβερσίνη, με την μεθοδολογία αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης για να γίνουν στη συνέχεια μελέτες ενός μορίου (single molecule experiments) και πειράματα διαφοροποίησης αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων προς οστεοκύτταρα, αντίστοιχα. Για τα ριβοσώματα που είχαν καθηλωθεί με την wtL4 και τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ριβοσώματα αναφοράς με κατάλληλο λογισμικό βρέθηκε ότι 241 ριβοσώματα συνέθεταν 100 GFPem, ή ένα ποσοστό περίπου 41%. Αντίθετα, ριβοσώματα με ενσωματωμένη την mutEcL22loop1 συνέθεταν την ίδια πρωτεΐνη σε μεγαλύτερο ποσοστό, περίπου 56%, αφού από 185 καθηλωμένα ριβοσώματα συντέθηκαν μόλις 104 μόρια GFPem, ενώ στην περίπτωση των ριβοσωμάτων με ενσωματωμένη την mutEcL4E51A, 1033 καθηλωμένα ριβοσώματα συνέθεταν 59 GFPem, δηλαδή σε ποσοστό περίπου 6% το οποίο είναι σημαντικά μειωμένο σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου. Και στις δύο περιπτώσεις τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε απόλυτη συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα που λήφθηκαν με ανασυγκροτημένα ριβοσώματα που είχαν ενσωματώσει τις ίδιες πρωτεΐνες (Δρ.Α. Τσαγκάλια και συνεργάτες, αδημοσίευτα αποτελέσματα, υπό συγγραφή). Συμπερασματικά το «νανο-σύστημα» που αναπτύχθηκε, επαλήθευσε και επιβεβαίωσε προηγούμενα ευρήματα σχετικά με την λειτουργία συγκεκριμένων περιοχών των συστατικών της πρωτεϊνοσύνθεσης και ενδείκνυται για μελέτες σε επίπεδο ενός μορίου. Στις επιφάνειες των υλικών PET/SiO2 ή PMMA-HEMA 5% καθηλώθηκαν λειτουργικά in vivo βιοτινιλιωμένοι πρωτεϊνικοί παράγοντες (BMP2) ή το χημικό ανάλογο πουρινών (ρεβερσίνη) που συντέθηκε χημικά και βιοτινιλιώθηκε in vitro. Aφού προηγουμένως διασφαλίστηκε ο μη τοξικός χαρακτήρας των υλικών που προαναφέρθηκαν, με την δοκιμασία ΜΤΤ, μελετήθηκε η επαγώμενη διαφοροποίηση αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων. Η ικανότητα της in vivo βιοτινιλιωμένης BMP2 στις επιφάνειες PMMA-HEMA 5% να διαφοροποιεί τα μεσεγχυματικά αρχέγονα κύτταρα σε οστεοκύτταρα, ανοίγει νέα μονοπάτια για τον σχεδιασμό και την κατασκευή μοσχευμάτων για αναδόμηση οστικού ιστού που έχει υποστεί βλάβη ή τραυματισμό. Επιπρόσθετα, βρέθηκε ότι η αποδιαφοροποιητική ικανότητα της ρεβερσίνης δεν περιορίζεται σε κύτταρα μίας γενεαλογίας και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάπλαση ιστών χρησιμοποιώντας οποιονδήποτε σωματικό τύπο κυττάρου αφού επαναπρογραμματίζει πνευμονικά κύτταρα MRC5 σε μια πολυδύναμη κατάσταση, τα οποία στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες.