A resistência bacteriana a antimicrobianos é um dos grandes desafios atuais para saúde pública. Uma importante preocupação é a alimentação fornecida em ambiente hospitalar, por sua capacidade de poder veicular genes de resistência aos antimicrobianos. Esse estudo teve como objetivo avaliar a resistência antimicrobiana, e caracterizar os genes de resistência de bactérias gram-negativas na microbiota de amostras de queijos servidos a pacientes internados em um hospital público do Rio de Janeiro. Esta pesquisa utilizou uma metodologia para captar a microbiota Gram-negativa resistente aos antimicrobianos. O teste de difusão em disco e a reação em cadeia da polimerase (PCR) foram realizados para investigar, respectivamente, a resistência fenotípica e genotípica de bactérias Gram-negativas aos antimicrobianos testados. As microbiotas de todas as amostras de queijo apresentaram alta resistência fenotípica. Em 62,5% das amostras, a resistência atingiu mais de nove antimicrobianos testados. Cinco antimicrobianos não apresentaram suscetibilidade em 100% das amostras analisadas. Com exceção do antimicrobiano ciprofloxacina, foram encontrados percentuais de resistência acima de 62% em todas as amostras, incluindo cefalosporina de quarta geração. Todas as amostras de queijo abrigavam genes de resistência. Foram encontrados sete diferentes genes de resistência, em 34 microbiotas de bactérias Gram-negativas, sendo eles: int-1, int-2, ctx, shv, tem, tetA e tetB. Concluímos a presença alarmante de genes potencialmente resistentes a antimicrobianos em queijos servidos a pacientes oncológicos, indicando que esse alimento pode ser um veiculador de bactérias com genes de resistência em ambiente hospitalar.