Atualmente, ensaios biológicos devem ser utilizados para avaliação da segurança para a saúde de produtos antes de irem para o mercado. O teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina (BCOP) é um método alternativo ao uso de animais que utiliza córneas bovinas frescas para avaliar o potencial irritante e corrosivo de qualquer substância em nível ocular. A necessidade de sempre ter que usar córneas viáveis faz com que o escalonamento deste teste seja mais difícil. Para superar esse desafio, a criopreservação de córneas pode ser uma possibilidade para se ter bancos de córneas disponíveis em qualquer momento. Apesar do sucesso obtido no congelamento de córneas humanas, o processo de congelamento pode causar danos ao endotélio e em bovinos não são conhecidos protocolos eficientes para esse fim. O objetivo desse trabalho é desenvolver um método de criopreservação de córneas bovinas para aplicação no teste de BCOP. Inicialmente, as córneas foram criopreservadas em meio DMEM com os crioprotetores (CPA) dimetilsulfóxido (DMSO) e etilenoglicol (EG), em combinações com dois adjuvantes, albumina sérica bovina (BSA) e soro bovino (SB). O controle foi feito a partir de córneas frescas e córneas criopreservadas com DMEM e adjuvante. O ensaio de intumescência foi feito para verificar a resistência do endotélio aos CPAs. Posteriormente, elas foram congeladas em duas temperaturas: -20°C e -80°C. Após congelamento, foi realizada a análise macroscópica da opacidade corneana e viabilidade celular pelo método de exclusão com azul de tripan (AT). A área celular do endotélio e a morfologia das células foram avaliadas a partir de coloração com vermelho de alizarina (VA). Além disso, cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina foram realizados para avaliar a integridade das diferentes camadas da córnea após a aplicação dos métodos de criopreservação estudados. Os dados de intumescência e viabilidade celular foram avaliados através de modelos lineares seguindo o critério de Akaike (AICc) e valores de R² (R² = 1 – erro relativo). Os resultados revelaram que as córneas só tiveram aumento de peso, significando um dano à camada endotelial, depois de 6 horas em contato com os CPAs (p < 0,05). Os tratamentos com CPAs foram diferentes do controle (p < 0,05) e os diferentes adjuvantes mantiveram o peso estabilizado, apresentaram diferença entre si (p < 0,05). O SB, que possui BSA em sua composição além de outras proteínas benéficas a criopreservação, foi escolhido como adjuvante para prosseguir o congelamento. A análise macroscópica revelou que o DMSO apresentou melhor transparência corneal. A viabilidade celular endotelial foi maior no tratamento controle, seguido por DMSO e EG, em ambas as temperaturas de congelamento. O congelamento em -20°C teve melhor resposta quando comparada ao -80ºC na viabilidade após criopreservação. Os danos do tratamento EG são evidenciados na análise morfológica e nas análises histológicas. Assim, os dados sugerem que o DMSO no congelamento tem potencial para a criopreservação de córneas bovinas, pois apresentou os melhores resultados nos parâmetros avaliados no presente trabalho. Adicionalmente, o congelamento em -20°C demonstrou potencial uso para a manutenção de córneas bovinas, com a vantagem de facilitar o armazenamento desses materiais em refrigeradores comuns.