Tinta cumi-cumi mengandung melanin yang berkhasiat sebagai antibakteri. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi etil asetat dan fraksi air tinta cumi-cumi (Loligo pealeii) dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa. Desain penelitian adalah penelitian quasi eksperimental dengan metode difusi cakram (Kirby-Bauer) menggunakan kertas cakram. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat tinta cumi-cumi yang memiliki aktivitas daya hambat terbesar yaitu konsentrasi 38% dengan rerata zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis sebesar 23,02 mm dengan kategori sangat kuat dan terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa sebesar 12,2 mm dengan kategori kuat, uji anova diperoleh hasil signifikan dengan nilai signifikansi 0,000<0,05, sedangkan fraksi air tinta cumi-cumi tidak memiliki zona hambat sehingga tidak ada perbedaan aktivitas antibakteri. Dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat tinta cumi-cumi memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa sedangkan fraksi air tinta cumi-cumi tidak memiliki penghambatan terhadap pertumbuhan kedua bakteri tersebut dengan konsentrasi yang paling efektif dari fraksi etil asetat tinta cumi-cumi yaitu konsentrasi 38%.Kata kunci: Antibakteri, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Tinta cumi-cumi.