Nilam (Pogostemon cablin Benth.) merupakan tanaman perkebunan penghasil minyak atsiri. Perbanyakan nilam secara in vitro dilakukan sebagai upaya memenuhi permintaan pasar. Penggunaan sistem fotoautotrofik pada kultur in vitro dilakukan melalui pengaturan konsentrasi gula dan jumlah ventilasi untuk mendapatkan pertumbuhan bibit terbaik. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai September 2020. Bahan tanaman yang digunakan berupa planlet steril nilam varietas Tapak Tuan koleksi BALITTRO. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan kelompok Lengkap Teracak dengan dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi gula (10, 20, dan 30 g L-1) dan faktor kedua adalah jumlah ventilasi (0, 2, dan 4 lubang). Hasil penelitian menunjukkan interaksi antara perlakuan konsentrasi gula dan jumlah ventilasi berpengaruh terhadap jumlah eksplan berkalus dan jumlah daun tanaman nilam. Hasil terbaik dalam multiplikasi tanaman nilam menggunakan media penambahan 20 g L-1 gula tanpa ventilasi yang meningkatkan jumlah daun sebanyak 9-61% dan jumlah buku sebanyak 20% pada 6 MSP dibandingkan perlakuan lainnya. Pemberian ventilasi 2 lubang meningkatkan jumlah akar 10-20%, jumlah dan kerapatan stomata 28-57% pada 6 MSP dibandingkan perlakuan lainnya. Peningkatan jumlah akar, jumlah dan kerapatan stomata pada eksplan yang tumbuh dalam sistem fotoautotrofik secara in vitro menunjukkan kemampuan untuk mengintegrasikan lingkungan dan diduga lebih mampu bertahan pada aklimatisasi untuk produksi bibit. Kata kunci: aklimatisasi, fotosintesis, in vitro, pengakaran, stomata