RESUMO A obtenção de cariótipos de peixes desempenha um papel importante em estudos de citotaxonomia e evolução cromossômica das espécies. No entanto, poucos sistemas semi ou completamente automatizados para a obtenção de cariótipo de peixes estão disponíveis. Este trabalho propõe e avalia uma ferramenta baseada em imagens que auxilie a montagem de cariótipos de peixes. As espécies analisadas foram Hopliasmalabaricus (Bloch, 1794); Hypostomusancistroides (Ihering, 1911) e Parauchenipterusgaleatus (Linnaeus, 1766); popularmente conhecidas como traíra, cascudo e bagre-sapo, respectivamente.Um total de 100 metáfases foi analisado por dois métodos: 1 - geração semiautomática de cariótipo e 2 - geração automática de cariótipo. A avaliação do sistema foi feita por meio da correlação de Pearson, gráficos de diferenças e tabelas de contagens,utilizando-se como referência a média das contagens feitas por quatro usuários. No método 1, quatro usuários realizaram contagens e apresentaram correlação interobservador de r≥ 0.997. O número total de cromossomos identificados pelo método 1 foi 4348 e, para o método 2, foi 4135,o que resultou em uma identificação automática de aproximadamente 95,1% dos cromossomos, resultando em correlação entre os dois métodos de r= 0.93. Conclui-se que a ferramenta pode ser inserida no procedimento de cariotipagem de peixes para acelerar o processo com níveis aceitáveis de exatidão.