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A colorimetric method for the determination of glycerides (Short communication) J.-TH. MORSEL and R. HEYERThe quantitative determination of lipids is, a universal and repeating problem of analytical chemistry in different fields, for example food-or biochemistry. Important criterions to value methods are the time needed for analysis, reproducibility and detection limit. The determination of glycerides can be performed by classical methods, for instance by the WEIBULL-STOLDT method [I] or by extraction. HPLC and GLC can be used successfully, too. All these methods are expensive of time or equipment.In this paper a colorimetric method is reported characterized by good reproducibility, great sensitivity and little time needed to perform. The determination, first time reported by FLETCHER [2] is based on the oxidation of glycerol after saponification of the lipid with periodate. The formaldehyde produced is determined by coupling a dye in a HANTZSCH condensation with ammonium ions and 2,4-pentadione. The 3,5-diacetyl-1,Cdihydrolutidin formed is measured in a photometer at 410nm. MaterialsPotassium hydroxide solution. 5 % in isopropanol/water, 4: 6 (v/v).Sodiummetaperiodate stock solution. 0.025 M in 1 N acetic acid. The working solution is prepared by mixing 12 ml stock solution, 20 ml isopropanol and 68 ml 1 N acetic acid. Acetylacetone solution. 0.75 ml 2,4-pentadion and 2.5 ml isopropanol are completed with 2 M ammonium acetate buffer (pH 6) to 100 ml. The pH should be determined exactly. The solution can be stored in dark bottles in a refrigerator.Water used for preparing the solution should be bidistilled. Isopropanol has to be free of n-alcohols. It has to be distilled before use.Standard solutions of glycerol (0.3 mg/100 ml), triolein (14 mg/100 ml) and tricaproin (3.5 mg/100 ml) are prepared by dissolving the substances in isopropanol/water 9: 1 (v/v). The triglycerides must be free of glycerol. This will be reached by filtration of crude products over a silica column. MethodsThe determination was performed by the FLETCH~X method [2] with some modifications. 2 ml of sample are shaken with 0.6 ml potassium hydroxide solution in a stoppered test tube and heated for I5 min to 60-70 "C. After cooling in a water bath to room temperature 1 ml of fresh prepared periodate solution is added and after shaking vigorously 0.5 ml acetylacetone solution is added and colour is developed at 50 "C within 30min. The colour is measured in a photometer at 410nm against isopropanol/water 9 : 1 (v/v). The extinction of a blank test (2 ml isopropanol/water and all reagents) is substracted. ResultsThe method has been tested with glycerol, triolein and tricaproin. Calibration curves are linear in a wide range (Fig. 1). In the experiments the minimum detectable concentration of glycerol was 70 pg/lOO ml. This indica-

Seit der Entdeckung des Vitamincharakters der Tocopherole im Jahre 1922 durch Evans u. a. [3] ist eine Vielzahl von Methoden zu ihrer qualitativen und quantitativen Bestimmung beschrieben worden. Vor allem in den letzten Jahren erlebten dabei die physikalischen und chromatographischen Methoden infolge der Verbesserung der Analysentechnik einen beträchtlichen Aufschwung.Unter den vielfältigen chemischen Bestimmungsmethoden, die auf der leichten Oxydierbarkeit des Tocopherols beruhen und sich lediglich in der Wahl der Oxydationsmittel und der quantitativen Erfassung der dabei entstehenden Reaktionsprodukte unterscheiden, kristallisierte sich das klassische Emmerie/Engel‐Verfahren (Reaktion mit Eisen(III)‐chlorid und Erfassung der entstehenden Eisen(II)‐ionen als Dipyridylkomplex) als ein häufig verwendetes und zuverlässiges Verfahren heraus. Durch Modifizierung, z. B. Kopplung mit der Dünnschichtchromatographie [4,6] und veränderte Aufarbeitungsschritte (z. B. [8]), wurde diese Methode auf die verschiedensten tocopherolhaltigen Substrate anwendbar. In der Routineanalytik setzen sich jedoch vor allem die GLC und HPLC zur qualitativen und quantitativen Tocopherolbestimmung durch. Ihre Vorteile liegen im geringen Aufwand für die Probenvorbereitung und der kurzen Analysenzeit bei hoher Trennleistung. Die Tocopherolbestimmung nach Jáky mit vorgeschalteter Dünnschichtchromatographie [6] ist für Konzentrationsbereiche von 400–800 ppm Tocopherole in pflanzlichen Ölen, wie Erfahrungen von Franzke u. a. [4] zeigen, sehr gut geeignet (Wiederfindung 88,1 ± 6,8%). Soll der Tocopherolgehalt aber in tocopherolangereicherten Proben bestimmt werden, versagt diese Methode. Aus diesem Grunde wurde nach einem einfachen Verfahren gesucht, das die Bestimmung höherer Tocopherolkonzentrationen mit guter Empfindlichkeit ermöglicht. Für diesen Zweck scheint die UV‐Photometrie geeignet zu sein, da die Tocopherole im Bereich zwischen 292 und 298 nm absorbieren. So bestimmt Indyk [5] die Vitamine A, E und β‐Caroten in Milchpulver durch UV‐Spektrophotometrie. Die quantitative UV‐spektroskopische Bestimmung der einzelnen Tocopherolhomologen im Standardgemisch (α‐, β‐, γ‐, δ‐Tocopherol) führen Bukovits u. a. [1] durch Bildung der 2. Ableitung der UV‐Spektren der einzelnen Homologen durch.

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Symmetrische Triglyceride des Typs SUS sind irn Vergleich zu unsymmetrischen des Typs SSU wegen ihrer besonderen Schmelzeigenschaften interessant. Die spezifische Einesterung langkettiger, ungesattigter Fettsauren in die 2-Position von gesattigten 1,3-Diglyceriden gelingt wegen Isomerisierungen (Acylwanderungen) unter den iiblichen Veresterungsbedingungen nicht [4]. Erst nach Uberfiihrung der ungesattigten Saure in ihr Saurechlorid verlauft der Umsatz rnit 1,3-Diglyceriden in Gegenwart von Pyridin nahezu isomerisierungsfrei [2], wobei jedoch die Darstellung solcher Saurechloride nicht unproblematisch ist. Der Einsatz vog Kupplungsreagenzien zur Veresterung langkettiger Carbonsauren rnit langkettigen Alkoholen, wie sie die Acylierung von 1,3-DigIyceriden darstellen wiirde, wird wegen der geringen Ausbeuten und auftretender Nebenprodukte nicht genutzt. Diese Nachteile sollen sich vermeiden lassen, wenn man derartige Acylierungen in Gegenwart von 4-Dialkylaminopyridin durchfuhn 111. Inwieweit damit die Darstellung positionsspezifischer, gemischtsauriger Triglyceride gelingt, d. h. Acylwanderungen am Partialglycerid ausbleiben, ist unbekannt (siehe auch [5]). Wir veresterten in Anlehnung an die Methode von NEISES u. a. [I] Olsaure (98,2% Gehalt nach GC) mit hochgereinigtern 1,3-Dipalmitin in Dichlormethan. Nach saulenchromatographischer Reinigung erhielten wir in 90 %iger Ausbeute ein Triglycerid, dessen gaschromatographische Analyse 68 % Palmitin-und 32 7;&lure ergab. Wie die diinnschichtchromatographische Analyse auf mit Silbernitrat impragniertem Kieselgel-G [3] belegt, konnen im Syntheseprodukt unsymmetrische Triglyceride des Typs SSU nicht nachgewiesen werden. Acylwanderungen wahrend der Synthese traten also nicht auf..Dieser Befund wird weiterhin durch die Tatsache belegt, daD auch nach der Reaktion die restlichen der im UberschuD eingesetzten 1,3-Diglyceride dunnschichtchromatographisch einheitlich sind, d. h. 1,2-Diglyceride nicht enthalten. Sornit hat man ein einfaches Verfahren in der Hand, um isomerenreine, gemischtsaurige Triglyceride zu synthetisieren. A rbeitsvorsehr ftZu 1 mmol Olsaure in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan p. a. werden unter Riihren bzw. Schiitteln 40 pmol 4-Dimethylaminopyridin p.a. und 2 mmol 1,3-Dipalmitin, die jeweils kurz vor Versuchsbeginn durch praparative DC gereinigt wurden, hinzugegeben. Die klare Losung wird auf 10 "C gekiihlt. Man setzt 1,I mmol Dicyclohexylcarbodiimid zu und riihrt 5 rnin bei 10 "C und weitere 2 h bei Raumtemperatur. Vom Harnstoffderivat, das bereits nach 15 min auszufallen beginnt, wird abfiltriert, die klare Losung rnit 0,5 N Salzsaure, mit gesattigter Natriurnhydrogencarbonat-Losung und rnit Wasser gewaschen, iiber Natriumsulfat getrocknet und nach Einengen saulenchromatographisch getrennt bzw. in der Kalte auskristallisiert. Die Ausbeute, nach Abtrennung der Nebenprodukte, betragt etwa 90 %.