No abstract

We report that enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) serotypes considered to be nonmotile produce an unusually large (77 kDa) flagellin that is assembled into functional flagellum filaments that allow the bacteria to swim in modified motility agar. The EIEC flagellin showed N-terminal identity to most common enterobacterial flagellins, especially those of the E. coli H7 serotype. These data are important in terms of the epidemiology, evolution, and biology of EIEC.

Non-motile enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) is serotyped based only on O antigen polymorphism, since H antigen epitopes, present on the flagellins, cannot be characterised in these bacteria. In this study, we demonstrate the presence of the flagellin-coding fliC gene in non-motile EIEC strains. Moreover, we were able to group the 11 most common non-motile EIEC serotypes into six different RFLP patterns of the fliC gene. Amplicons representing each RFLP pattern were sequenced. Sequencing data were used to construct a phylogenetic tree which showed two main clusters: one sharing similarity with Shigella dysenteriae and pathogenic E. coli, and the other being closer to non-pathogenic E. coli.

3.4-Obtenção dos macrófagos de camundongo 28 3.5-Extração de RNA e síntese de DNA complementar 29 3.6-PCR em tempo real 29 3.7-RT-PCR semiquantitativo 30 3.8-"Enzyme-Iynked immunosorbent assay" (ELISA) para quantificação 32 das citocinas 3.9-Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro') 33 3.9.1-Sobrevivência bacteriana no interior dos macrófagos-33 3.9.2-Escape bacteriano após fagocitose e determinação da viabilidade dos macrófagos 3.9.3-Produção de citocinas por macrófagos infectados 3.10-Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO (ensaios "in vitro") 3.10.1-Produção de óxido nítrico (NO) 3.10.2-Transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e do TLR4 3.10.3-Produção de TNF-a e IL-10 3.11-Interação entre EIEC e camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO "in vivo" 3.11.1-Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção 3.11.2-Análise da transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e do TLR4 3.11.3-Produção de TNF-a e IL-10 39 3.11.4-Determinação da mortalidade de camundongos C57BU6 e 39 C57BU6 iNOS KO após infecção 3.12-Resposta de linfócitos à infecção por EIEC 40 3.12.1-Ensaio de linfoproliferação 40 3.12.1.1-Obtenção de linfócitos 40 3.12.1.2-Obtenção de Antígenos Solúveis 40 3.12.1.3-Linfoproliferação 41 3.12.2-Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4 42 3.12.3-Determinação das subpopulações de linfócitos 4. Resultados 4.1-Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro") 4.1.1-Determinação do número de bactérias viáveis no interior de macrófagos J774 após fagocitose 4.1.2-Determinação do escape bacteriano após fagocitose 4.1.3-Determinação da viabilidade dos macrófagos infectados 4.1.4-Cinética da transcrição dos genes de TNF-a, IL-1 e IL-10 por PCR em tempo real 4.1.5-Determinação da produção de TNF-a, IL-1 e IL-10 por ELISA 4.2-Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO (ensaios "in vitro") 4.2.1-Determinação da produção de NO pelo método de Griess 52 4.2.2-Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, da enzima 53 iNOS e do TLR4 por RT-PCR semiquantitativo 4.2.3-Determinação da produção de TNF-a e IL-10 por ELISA 60 4.3-Interação entre EIEC e camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO 63 "in vivo" 4.3.1-Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção 63 4.3.2-Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, iNOS 68 eTLR4 por RT-PCR semiquantitativo 4.3.3-Determinação da produção de IL-1, IL-10 e IFN-y por ELISA 77 4.3.4-Determinação da mortalidade de camundongos C57BU6 e 82 C57BU6 iNOS KO após infecção 4.4-Resposta de linfócitos à infecção por EIEC 4.4.1-Linfoproliferação 4.4.2-Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4 4.4.3-Determinação das subpopulações de linfócitos 5. Discussão 6. Conclusões 7. Referências Bibliográficas 111