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A utilização de sêmen de equinos de elevado mérito genético aumenta a cada ano, uma vez que a técnica de reprodução assistida mais comum nessa espécie é a inseminação artificial, com sêmen fresco, refrigerado ou congelado. Essa alta demanda mercadológica obriga a entrega de um produto de qualidade. Entretanto, nem todos os machos possuem uma boa congelabilidade e, com isso, a maneira mais usual de transporte é resfriando o sêmen após diluição prévia. O preparo do sêmen para resfriamento requer um processo de separação dos espermatozoides e isso pode causar danos irreversíveis. O presente estudo teve por objetivo avaliar a influência de diferentes métodos de separação espermática na melhoria do sêmen resfriado. Foram utilizados três garanhões e o ejaculado, após avaliação de motilidade e vigor, foi diluído e dividido em três grupos: um grupo controle (CONT), sem passar pela centrifugação; um grupo centrifugado (CENT) e o terceiro grupo foi usado o SpermFilter (SPERM). Após essa etapa, o sêmen foi resfriado por 24 horas. Os parâmetros pós resfriamento analisados foram: integridade de membrana, por meio da coloração eosina/negrosina e patologia espermática, divididos em espermatozoides normais, com defeitos maiores e menores, de acordo com o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Os dados foram analisados por ANOVA e o nível de significância de 5% foi utilizado. Não houve diferença significativa (média ± desvio padrão) no número de espermatozoides normais (CONT: 78,2 ± 15,1; CENT: 68,5±19,3 e SPERM: 75,8±11,5) nem no número de defeitos maiores (CONT:15,2±8,4; CENT:12,7±9,2 e SPERM:17,7±12,8) e menores (CONT: 15,8±10,9; CENT: 19±10,8 e SPERM: 14,2±8,5) entre os tratamentos (p>0,05). A integridade de membrana espermática foi similar (p>0,05) entre os tratamentos, onde a quantidade de espermatozoides com membrana rompida foi de 99%±1,3 para o grupo CONT; 85,3±31,6 para o CENT; 76,3±37 para o grupo SPERM. Diante do exposto, não houve influência do método de separação espermática nos parâmetros analisados
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