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SUMMARYThe infectious pancreatic necrosis virus, IPNV, is the etiological agent of a highly contagious disease that affects young salmon. The virus is mostly horizontally transmitted; therefore virus quantitation in water is mandatory for a proper sanitary management in the salmon industry as well as in the environment close to the hatcheries. To evaluate the water as a risk factor for IPNV infection in cultured or wild animals, it is necessary to titrate the virus with a suitable sensitivity. Therefore, a methodology that allows IPNV concentration to be determined in water using two kinds of ultrafiltration was developed. One, based on the tangential flow of the sample along the surface of a membrane, the other based on the retention of the viral particles at the surface of membranes with controlled pore diameter. Reagents and conditions were selected to reduce virus inactivation and/or virus binding to the filters. Finally, a protocol was developed that allows the concentration of IPNV in three orders of magnitude and with a total recovery of infectivity to be determined. This method can be performed in less than one day including virus titration using the fluorescent foci method INTRODUCCIONEl virus de la necrosis pancreática infecciosa (virus IPN) es considerado como el virus de especies salmonídeas más prevalente en el mundo. Es el agente responsable de la necrosis pancreática infecciosa (IPN), enfermedad que es una de las principales patologías a las que se ha visto enfrentada la salmonicultura nacional y mundial en los últimos 10 años. Según datos recientes, los brotes del virus IPN en el país afectaron al 48% del total de las pisciculturas, al 61% de los centros de esmoltificación y al 49% de los centros de engorda en 1999 (FIP 2003) provocando enormes pérdidas al sector.El virus IPN causa una infección sistémica aguda en alevines de 1 a 6 meses de edad, pudiendo provocar, incluso, mortalidades acumulativas del orden del 100% de la población afectada. Los peces sobrevivientes permanecen en estado portador de por vida, diseminando el virus por largo tiempo, manteniendo así el virus en el agua (Wolf 1988). Sólo la detección del virus activo causante de la necrosis pancreática infecciosa puede indicar el verdadero nivel de riesgo para una piscicultura. Las técnicas empleadas con este propósito suelen ser lentas en su aplicación, sin embargo, recientemente se desarrolló una téc-nica que permite titular al virus IPN en menos de 20 h. La metodología se basa en la visualización mediante microscopia de epifluorescencia (MEF) de la amplificación del virus en células CHSE-214. Las células infectadas (fluorescencia positiva) son cuantificadas como Focos Fluorescentes (FF) de forma equivalente a la técnica de unidades formadoras de placas (Espinoza y Kuznar 2002).Para desarrollar la enfermedad un animal debe estar expuesto a una concentración mínima de virus; en principio, para el virus IPN, ésta debiera ser sobre 1x10 2 UFP/l

ABSTRACT. Diatoms play a decisive role in global primary production, have a key role in the marine food web, and serve as food for the industrial culture of aquatic animals. In addition, species of diatoms have been chosen as tools for measuring sea water quality and for bioassay procedures. Among them, Phaeodactylum tricornutum (Bohlin) Lewin, 1958, represents a good biological model due to its ease of handling and also to its physiological, genetic and growth characteristics. We investigated the use of the Epifluorescence Microscopy (EPM) to visualize and enumerate P. tricornutum cells and bacteria in cultures containing both kinds of microorganisms. The cell suspension was filtered, stained with SYBR Green and analyzed by EPM. P. tricornutum can be enumerated using EPM with comparable accuracy as using a hemocytometer. The same kind of growth curve is obtained with either method. EPM is an advantageous alternative to the classic light microscope counting method; it allows the simultaneous enumeration of P. tricornutum and bacteria in a single sample, measuring red autofluorescence and green fluorescence respectively. Moreover, the methodology is suitable for dynamic studies performed to determine the growth dependence between P. tricornutum and bacteria. Another advantage of this technique is that different shapes, sizes and physiological stages of the microbiological communities can be observed.Key words: microscopic algae, bacteria, growth, enumeration, epifluorescence.Enumeración simultánea del crecimiento de Phaeodactylum tricornutum (MLB292) y bacterias en comunidades mixtas RESUMEN. Las diatomeas tienen un rol decisivo en la producción primaria global, un rol clave en la red trófica marina y sirven como alimento en el cultivo industrial de animales acuáticos. Algunas especies han sido elegidas para medir la calidad del agua y para bioensayos. Entre ellas, Phaeodactylum tricornutum (Bohlin) Lewin, 1958, representa un buen modelo biológico debido a su fácil manejo, como también a sus características fisiológicas, genéticas y de crecimiento. Se analiza el uso de la Microscopía de Epifluorescencia (MEP) para visualizar y enumerar células de P. tricornutum y bacterias en cultivos que contienen ambos tipos de microorganismos. Las células en suspensión fueron filtradas, marcadas con SYBR Green y analizadas con MEP. Las células de P. tricornutum se pueden contar con una precisión comparable a la del hemocitómetro y se obtiene la misma curva de crecimiento con ambos métodos. La MEP es una alternativa ventajosa al uso del clásico microscopio de luz, ya que permite el recuento simultáneo de P. tricornutum y bacterias en una misma muestra, midiéndose la autofluorescencia roja y la fluorescencia verde, respectivamente. Más aún, la metodología es apropiada para estudios de dinámica y para determinar la dependencia entre el crecimiento de P. tricornutum y las bacterias. Otra ventaja de esta técnica es que se puede observar diferencias de forma, tamaño y estado fisiológicos de las comunidades microbiológicas.Palabras ...