The non-heme iron enzyme EgtB catalyzes O2 -dependent C-S bond formation between γ-glutamyl cysteine and N-α-trimethyl histidine as the central step in ergothioneine biosynthesis. Both, the catalytic activity and the architecture of EgtB are distinct from known sulfur transferases or thiol dioxygenases. The crystal structure of EgtB from Mycobacterium thermoresistibile in complex with γ-glutamyl cysteine and N-α-trimethyl histidine reveals that the two substrates and three histidine residues serve as ligands in an octahedral iron binding site. This active site geometry is consistent with a catalytic mechanism in which C-S bond formation is initiated by an iron(III)-complexed thiyl radical attacking the imidazole ring of N-α-trimethyl histidine.

EgtB from Mycobacterium thermoresistibile catalyzes O2-dependent sulfur-carbon bond formation between the side chains of Nα-trimethyl histidine and γ-glutamyl cysteine as a central step in ergothioneine biosynthesis. A single point mutation converts this enzyme into a γ-glutamyl cysteine dioxygenase with an efficiency that rivals naturally evolved thiol dioxygenases.

Sulfoxide synthases are non-heme iron enzymes that catalyze oxidative carbon-sulfur bond formation between cysteine derivatives and N-a-trimethylhistidine as a key step in the biosynthesis of thiohistidines. The complex catalytic mechanism of this enzyme reaction has emerged as the controversial subject of several biochemical and computational studies. These studies all used the structure of the g-glutamyl cysteine utilizing sulfoxide synthase, MthEgtB from Mycobacterium thermophilum (EC 1.14.99.50), as a structural basis. To provide an alternative model system we have solved the crystal structure of CthEgtB from Chloracidobacterium thermophilum (EC 1.14.99.51) that utilizes cysteine as a sulfur donor. This structure reveals a completely different configuration of active site residues that are involved in oxygen binding and activation. Furthermore, comparison of the two EgtB structures enables a classification of all ergothioneine biosynthetic EgtBs into five sub-types, each characterized by unique active-site features. This active site diversity provides an excellent platform to examine the catalytic mechanism of sulfoxide synthases by comparative enzymology, but also raises the question as to why so many different solutions to the same biosynthetic problem have emerged.

Sulfoxide synthases are non-hemei ron enzymes that participatei nt he biosynthesis of thiohistidines, such as ergothioneine ando vothiol A. The sulfoxide synthase EgtB from Chloracidobacterium thermophilum (CthEgtB) catalyzes oxidative coupling between the side chains of N-a-trimethyl histidine( TMH) and cysteine (Cys) in ar eaction that entails complete reduction of molecular oxygen,c arbon-sulfur (CÀ S) and sulfur-oxygen (SÀO) bond formationa sw ell as carbon-hydrogen (CÀH) bond cleavage. In this report, we show that CthEgtB and other bacterial sulfoxide synthases cannote fficiently accept selenocysteine (SeCys) as as ubstrate in place of cysteine. In contrast, the sulfoxide synthase from the filamentous fungus Chaetomium thermophilum (CthEgt1) catalyzes CÀSa nd CÀSe bond formation at almost equale fficiency.W ed iscuss evidence suggesting that this functional differenceb etween bacterial and fungal sulfoxide synthases emerges from different modes of oxygen activation.[a] K.

Das eisenhaltige Nicht-Häm-Enzym EgtB katalysiert die sauerstoffabhängige Bildung einer KohlenstoffSchwefel-Bindung zwischen g-Glutamylcystein und N-a-Trimethylhistidin als zentralen Schritt der Ergothionein-Biosynthese. Sowohl die katalytische Aktivität als auch die 3D-Struktur von EgtB unterscheiden sich von bisher bekannten Schwefel-Transferasen oder Thiol-Dioxygenasen. Die Kristallstruktur von EgtB aus Mycobacterium thermoresistibile im Komplex mit g-Glutamylcystein und N-a-Trimethylhistidin zeigt die zwei Substrate und drei Histidinreste als Liganden der oktaedrischen Eisenbindestelle. Diese Geometrie des aktiven Zentrums passt zu einem katalytischen Mechanismus, in dem die Bildung der Kohlenstoff-Schwefel-Bindung von einem Eisen(III)-komplexierten Thiyl-Radikal initiiert wird, indem dieses den Imidazolring des N-a-Trimethylhistidins angreift.Ergothionein (1, Schema 1) kommt in vielen pro-und eukaryotischen Organismen vor, einschließlich dem Menschen und Humanpathogenen wie Mycobacterium tuberculosis.[1] Es wird von hçheren Eukaryoten als bakteriell produzierter Mikronährstoff aufgenommen. Die genaue zelluläre Funktion von Ergothionein ist unklar, jedoch lassen jüngste Beobachtungen in bakteriellen, tierischen und pilzstämmigen Zellen darauf schließen, dass die Schwefelverbindung vor oxidativem Stress schützt.[2] Mycobakterien synthetisieren Ergothionein aus Glutamat, Cystein und Histidin. [1d, 3] Der zentrale Schritt in dieser Biosynthese wird von dem eisenhaltigen Nicht-Häm-Enzym EgtB katalysiert, das unter Sauerstoffverbrauch eine C-S-Bindung zwischen N-a-Trimethylhistidin (2, TMH) und g-Glutamylcystein (gGC) bildet und sulfoxidiert. Zusammen mit dem Ovothiol-Biosyntheseenzym OvoA [4] (4, Schema 1) repräsentiert EgtB eine separate Enzymklasse (Sulfoxid-Synthasen), die sich von anderen Schwefel oxidierenden oder C-S-kuppelnden eisenhaltigen Enzymen wie Cystein-Dioxygenasen oder IsopenicillinSynthasen abgrenzt.[5] Vielmehr stellen Sulfoxid-Synthasen eine neue Facette in der vielfältigen Biokatalyse der C-SKupplung dar. [6] Um die molekulare Grundlage der Sulfoxid-Synthaseaktivität aufzuklären, wurden Kristallstrukturen von EgtB aus Mycobacterium thermoresistibile (EgtB thermo ) im ternären Komplex mit Eisen und TMH sowie als quaternärer Komplex mit Mangan, N-a-Dimethylhistidin (DMH) und gGC bestimmt. Das Enzym wurde in Escherichia coli produziert und nach Protokollen gereinigt, die bereits für EgtB aus Mycobacterium smegmatis (EgtB smegmatis ) etabliert worden waren.[1d]Die Sequenzhomologie der beiden Enzyme beträgt 81 %, sie sind Monomere (Abbildung S1) und zeigen ähnliche In-vitroAktivitäten (Tabelle 1). Die rekombinant hergestellten Enzyme wurden als eisenhaltige Holoenzyme aufgereinigt. Ihr Eisengehalt wurde sowohl in einem Ferrozin-basierten kolorimetrischen Test (EgtB thermo > 95 %, EgtB smegmatis > 50 %, Tabelle S1) als auch durch Titration der EgtB-Aktivität gegen FeSO 4 (Abbildung S2) bestimmt. Ihre In-vitro-Aktivitäten wurden in HEPES-gepufferten Lçsungen in Gegenwart von TMH, gGC, 4...