RESUMO Considerando que, entre todas as fontes de erro analítico, a hemólise é a mais importante na rotina laboratorial, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito da hemólise in vitro sobre os principais biomarcadores plasmáticos de estresse oxidativo mensurados (BPEO) de cães. Para tal, amostras de sangue total de 19 cães clinicamente saudáveis foram hemolisadas em diferentes graus por ação mecânica. Amostras controle contendo baixa concentração de hemoglobina (Hb) no plasma foram comparadas com quatro graus de hemólise (<0,36; 0,36-0,60; 0,61-1,0; 1,1-4g/L Hb). Imediatamente após a hemólise, foram mensuradas as concentrações plasmáticas de ácido úrico (AU), albumina, bilirrubina, gamaglutamiltransferase (GGT), capacidade antioxidante total (TAC) e concentração de oxidante total (TOC). Os erros relativos causados pelos diferentes graus de hemólises foram calculados e confrontados com o erro total aceitável (ETA) e com o limite de erro permitido (LEP) empregados nos programas de controle de qualidade de exames laboratoriais. Foi observado que mesmo pequeno grau de hemólise gera algum erro analítico não aceitável (ETA e/ou LEP) nos BPEO mensurados, exceto na bilirrubina. Foi possível concluir que a hemólise é um fator limitante para avaliação do estresse oxidativo sistêmico mensurado no plasma, podendo causar erros que potencialmente comprometem o diagnóstico clínico.