Introducción. Las candidiasis son un grupo de infecciones oportunistas causadas por levaduras del género Candida. C. albicans es la especie de mayor prevalencia en infecciones superficiales y profundas, sin embargo en la actualidad la frecuencia de especies no albicans, ha incrementado considerablemente su relevancia clínica en la última década, haciendo obligatoria la utilización de técnicas diagnósticas que permitan la identificación de especies para el manejo terapéutico adecuado de los pacientes.Objetivo. Diseñar y optimizar una técnica de PCR múltiplex considerando parámetros termodinámicos, para la identificación simultánea de cinco especies de Candida relevantes en la etiología de candidiasis humana.Materiales y métodos. Para el diseño de los cebadores se consideraron restricciones físicas y termodinámicas que afectan la PCR múltiplex, usando Gene Runner y Mult-PSOS. Como secuencias base se utilizaron: región transcrita interna 2 (ITS2) (AJ249486.1) para C. albicans y topoisomerasa II (TOPII) para C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1) y C. guillermondii (AB049145.1). Como moldes fueron utilizados extractos de ADN total obtenidos de cepas ATCC y aislamientos clínicos de las especies de Candida.Resultados. Se diseñaron 10 cebadores para la amplificación simultánea de las especies de Candida. El patrón de bandas obtenido fue: C. albicans (206pb), C. guillermondii (244pb), C. tropicalis (474pb), C. parasilopsis (558pb) y C. krusei (419pb).Conclusión. El ensayo de PCR múltiplex diseñado permitió la amplificación simultánea y eficiente de todos los amplicones correspondientes a las especies de Candida estudiadas, las cuales presentaron una adecuada resolución en gel de agarosa al 1,3%.