Esta investigación tuvo como objetivo definir la metodología de extracción de ADN y purificación para Moniliophthora roreri y aplicarla a 56 aislamientos de Moniliophthora roreri obtenidos en los municipios y corregimientos de Cúcuta, Agua Clara, Sardinata, El Tarra, Tibú, Bucarasica, Teorama y El Zulia del departamento de Norte de Santander (Colombia). Se realizó la extracción de ADN, utilizando el protocolo propuesto por Miranda y Sandoval en el año 2000 con algunas modificaciones propuestas por Rocha. Para su purificación se utilizó fenol cloroformo. Una vez se estandarizó el protocolo de extracción, se probó con otros hongos: Metarhizium sp, Botritys cincrea, Fusarium culmorum, Phytophthora cinnamomi. Con este trabajo se pretende continuar con la investigación en el área de Biología Molecular de Moniliophthora roreri y otros fitopatógenos de importancia económica para la región, fomentando así la investigación.Palabras Clave: Moniliophthora roreri; biología molecular; aislamiento de ADN; fitopatógenoABSTRACT This research has as objetive to define the methodology of extraction and purification for Moniliophthora roreri and to apply it to 56 isolations of Moniliophthora roreri obtained from Cúcuta, Agua Clara, Sardinata, El Tarra, Tibú, Bucaracica, Teorama and Zulia in Norte de Santander (Colombia). The extraction of DNA was carried out by the protocol proposed by Miranda and Sandoval in 2000, with some proposed modifications by Rocha. To its purification was utilized Chloroform Phenol. Once, it was standarized by the protocol of extraction. It tested with other mushrooms: Metarhizium sp, Botritys cincrea, Fusarium culmorum, Phytophthora cinnamomi. This work intends to continue with the research in the area of Molecular Biology of Moniliophthora roreri and other phytopathogens of economic importance for the region, it promotes the research in micology.Key words: Moniliophthora roreri, Molecular Biology, Isolation of DNA, Phytopathogen.

Este proyecto de investigación definió las zonas de influencia de la moniliasis. Se aisló e identificó el hongo Moniliophthora roreri causante de la enfermedad. Se obtuvieron 56 muestras en: Agua Clara, Tibú, Sardinata, El Tarra, Bucarasica, El Zulia, Teorama y Cúcuta en el Nororiente Colombiano. Se identificó el hongo a nivel morfológico por medio de montajes en el microscopio. Confirmada la presencia del hongo, las muestras se conservaron en placas con agar papa dextrosa. Se realizaron pruebas preliminares de inhibición antagónica mediante la técnica Igarashi con Trichoderma sp. El Zulia, Trichoderma sp. Iscalá y Trichoderma sp. de Cuba, donde se evidenció la posibilidad de controlar biológicamente al fitopatógeno Moniliophthora roreri. Se obtuvieron resultados preliminares favorables del 55% de inhibición antagónica. También se realizaron aislamientos de seis nuevas cepas de Trichoderma sp. y un Bacillus sp.Palabras Clave: Moniliasis; Moniliophthora roreri; biocontrol; antagonismo; aislamiento de hongos. ABSTRACT This proyect of researching defines the influence zones of the Moniliasis. In this project was isolated and identified the Moniliophthora roreri, the disease is caused by this fungus. 56 samples were goteen in Agua Clara, Tibú, Sardinata, El Tarra, Bucarasica, El Zulia, Teorama and Cúcuta in the Colombia Nororiente. The fungus was identified in a morphological level by means of microscopical test, the samples were conserved on the plates, added potato dextrose agar. Preliminary of antagonistic inhibition though the Igarashi technique, they were made on Trichoderma sp. El Zulia, Trichoderma sp. Iscalá, Trichoderma sp. of Cuba, where it was demonstrated that the controlling biological of phytopathogen Moniliophthora roreri. Finally, 55% of results were obtained from antagonistic inhibition. Also, the isolations of six new stocks of Trichoderma sp. were made, and a Bacillus sp. too.

Bacterial identification is carried out by conventional methods based on phenotypic characteristics, since their implementation and costs are more easily accessible. However, molecular identification allows us to know the true identity of the genus and species. The molecular identification of 24 bacterial strains preserved in the Strain Bank of the University Francisco de Paula Santander, Campos Eliseos Experimental Center, identified under macroscopic and microscopic phenotypic criteria, was carried out. Initially, the strains preserved in saline solution were reactivated and characterized macro- and microscopically, then DNA extraction was performed and PCR was done to amplify the 16S rRNA region allowing access to the DNA sequence of interest; the samples were sent to be sequenced and through bioinformatic tools the identity of each bacterium was known. The strains: BLB003, BLB009, BLB011, BLB012, BLB014, BLB016, BLB018, BLB022, BLB023, BLB024, BLB033, were identified as Bacillus cereus; BLB010 as Bacillus thurigiensis; while BLB030, BLB031, BLB032, as Bacillus pumilus; BLB020 as Bacillus amyloliquefaciens; BLB001, BLB004, BLB007, and BLB037, formed the group of Bacillus subtilis; and it is possible that there are divergent ramifications between species of Bacillus in phylogenetic trees. Another grouping that was observed in the phylogenetic tree are the strains BLB019 and BLB029 that correspond to Achromobacter xylosoxidans and Alcaligenes faecalis respectively. Also another group BLB013 and BLB017, were identified as Stenotrophomonas maltophilia. It is important to take into account that sometimes 16S rRNA presents a low discrimination capacity for some genera and species due to recent divergences, it is necessary to complement the identification with the study of other genes.

RESUMENEl cultivo de cacao, está afectado por el fitopatógeno Moniliophthora roreri, que causa gran pérdida en la producción en Norte de Santander. Este estudio muestra los resultados obtenidos utilizando AFLPs de M. roreri. Con el kit para sistema de análisis II, estandarizado y aplicado a 56 muestras de M. roreri, aisladas de nueve municipios. La combinación que presentó mayor número de polimorfismos fue E-ACC/ M-CAA, con 100 bandas y un número menor de alelos (6), con la combinación E-ACG/ M-CAA se obtuvieron 90 bandas y un número de alelos mayor (23), y con la combinación E-AAC/ M-CAA se presentaron 94 bandas y alelos (12). El análisis de datos se realizó según el dendrograma de similitud o distancias genéticas de Nei, obteniéndose cinco grupos con una alta variabilidad entre las muestras, del 6,5 al 58%. Al combinar la información morfológica y molecular se determinó el nivel de diversidad genética de Moniliophthora roreri.

ResumenAntecedentes: Moniliophthora roreri es el agente causal de la moniliasis del cacao, enfermedad limitante que presentan las regiones productoras de cacao (Theobroma cacao L.), siendo el principal problema fitosanitario para Colombia. Conocer el comportamiento de M. roreri In vitro, es importante para su estudio. Además, continuar con los trabajos que definan la estructura genética de las poblaciones del fitopatógeno es interesante pues refleja su historia evolutiva y su potencial para evolucionar. Objetivo: Observar el crecimiento y desarrollo de 11 aislamientos de M. roreri obtenidos de 6 municipios de Norte de Santander: El Zulia, Cúcuta, Sardinata, El Tarra, Agua Clara, Tibú, para estandarizar ADN polimórfico Amplificado al Azar. Métodos: Se probaron cinco métodos de incubación para el aislamiento del fitopatógeno en PDB, el método donde el hongo permaneció en agitación 1 día a 120 rpm con periodos luz/oscuridad de 12h/1 Universidad Francisco de Paula Santander 2h a temperatura de 25 a 28°C, e incubación a 28°C en completa oscuridad; mostró mejores resultados, al observar crecimiento del micelio de M. roreri durante 8 días razón por la cual se continuó con la extracción del ADN de los aislamientos, y se estandarizó la técnica RAPD (ADN Polimórfico Amplificado al Azar). Resultados: La incubación a 28°C en completa oscuridad, mostró mejores resultados en cuanto al crecimiento del hongo y se logró estandarizar los RAPDs con el Oligo 4, Oligo 8, Oligo10 y OPA 10. En la PCR, con una temperatura de desnaturalización de 94°C por cinco minutos, 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, temperatura de alineamiento de 36°C (para el Oligo 8 y 10) y 32°C (para el Oligo 4 y OPA 10) por un minuto, 72°C por 2 minutos y un ciclo final de 72°C por 7 minutos. Conclusión: se logró determinar la temperatura de incubación de 28°C en oscuridad y estandarizar la técnica RAPDs para Moniliophthora roreri.Palabras claves: ADN, cacao, marcador molecular, patógeno de cacao. AbstractBackground: Moniliophthora roreri is the causal agent of cocoa moniliasis, a limiting disease presented by cocoa producing regions (Theobroma cacao L.), being the main phytosanitary problem for Colombia. Knowing the behavior of M. roreri In vitro, it is important for its study. In addition, continuing the work that defines the genetic structure