Thalassia testudinum es la planta marina de mayor abundancia en el litoral de La Habana y del Caribe en general, conocida comúnmente como praderas submarinas o hierba de tortuga. Entre los compuestos de interés que se pueden encontrar en esta especie sobresalen los polifenoles, los cuales son componentes estructurales de su pared celular y poseen propiedades funcionales y bioactivas como antioxidante, anti-inflamatorio, neuroprotector y hepatoprotector. Investigaciones previas evaluaron diversos métodos de extracción de compuestos bioactivos para esta especie, por lo que este trabajo tuvo como objetivo optimizar las condiciones de extracción del contenido de polifenoles totales. Para ello se utilizó el método de Box y Hunter y se evaluó el efecto de tres factores influyentes en la extracción de compuestos fenólicos (velocidad de agitación, relación material vegetal/% alcohol y concentración de etanol). Como variable respuesta se empleó el contenido de polifenoles totales determinada por el método de Folin-Ciocalteu. Los resultados del diseño proporcionaron como condiciones óptimas en las variables estudiadas las siguientes: 1/11.5 p:v, 60% de EtOH y 800 r.p.m., alcanzando rendimiento de polifenoles totales, igual a 25.60 mg/g de extracto seco; superior a las restantes condiciones de extracción para un extracto bioactivo con potencialidades de uso en la industria farmacéutica o nutracéutica.