Numerous protocols have been published for extracting DNA from phlebotomines. Nevertheless, their small size is generally an issue in terms of yield, efficiency, and purity, for large-scale individual sand fly DNA extractions when using traditional methods. Even though this can be circumvented with commercial kits, these are generally cost-prohibitive for developing countries. We encountered these limitations when analyzing field-collected Lutzomyia spp. by polymerase chain reaction (PCR) and, for this reason, we evaluated various modifications on a previously published protocol, the most significant of which was a different lysis buffer that contained Ca2+ (buffer TESCa). This ion protects proteinase K against autolysis, increases its thermal stability, and could have a regulatory function for its substrate-binding site. Individual sand fly DNA extraction success was confirmed by amplification reactions using internal control primers that amplify a fragment of the cacophony gene. To the best of our knowledge, this is the first time a lysis buffer containing Ca2+ has been reported for the extraction of DNA from sand flies.

Gregarines that parasitise phlebotomine sand flies belong to the genus Psychodiella and, even though they are highly hostspecific, only five species have been described to date. Their most outstanding features include the unique localisation of the oocysts in the accessory glands of the female host, which ensures contamination of the egg surface during oviposition, and the fact that they naturally parasitise the vectors of Leishmania, causal agent of leishmaniasis. The type species, Ps. chagasi, was first described in Lutzomyia longipalpis, vector of visceral leishmaniasis (VL), from Brazil. We recently reported Ps. chagasi sequences in Lu. longipalpis from Posadas (Misiones, Argentina), an endemic VL location where this gregarine had not been previously recorded. In order to analyse the incidence of Ps. chagasi infections in Lu. longipalpis from this location, the aim of this study was to develop a diagnostic assay for sand fly gregarine parasites in Lu. longipalpis. For this, we designed primers using the Ps. chagasi sequences we previously identified and performed an in vitro validation by PCR amplification of the original sand fly samples. Their specificity and sensitivity as diagnostic primers were subsequently confirmed by PCR reactions using total DNA extracted from naturally infected Lu. longipalpis from the same location (Posadas, Argentina). Journal of Vector Ecology 39 (1): 83-93. 2014.

La leishmaniasis es una enfermedad transmitida por vectores que tienen una ecología y epidemiología complejas. Se manifiesta clínicamente de cuatro maneras principales de las cuales la leishmaniasis visceral (LV) es la más severa, ya que es fatal si no es tratada (Desjeux, 1996). Esta "Enfermedad de la Pobreza" es un serio problema de salud pública a nivel mundial y, recientemente, a nivel nacional. Actualmente, no existe una vacuna para su prevención, y el tratamiento con drogas es un procedimiento caro que acarrea efectos secundarios indeseables. La leishmaniasis es causada por un protista parásito, <i>Leishmania</i> spp., y transmitida a los humanos por insectos flebótomos. En Latinoamérica, LV es causada por <i>Leishmania infantum</i> (syn. chagasi) y transmitida por <i>Lutzomyia longipalpis</i> (WHO, 2010). Este flebótomo solamente se encuentra en el Nuevo Mundo, con una amplia distribución desde México hasta Argentina. Entre 1925 y 1989, en Argentina se reportaron 14 casos humanos de leishmaniasis pero ninguno fue atribuído a <i>Le. infantum</i> y, adicionalmente, sólo hubo 2 registros aislados de <i>Lu. longipalpis</i> sin reporte de LV (en 1951 y 2000). Sin embargo, debido al avance indiscriminado de la urbanización, que acarrea pobreza y condiciones insalubres, recientemente se describió el primer foco de LV en Argentina (Salomón et al., 2008). La mejor manera de interrumpir cualquier enfermedad transmitida por vectores consiste en reducir el contacto humano-vector. Las estrategias dirigidas a los vectores son especialmente atractivas debido a que la capacidad vectorial para transmitir enfermedades infecciosas a los humanos es proporcional a la densidad del vector y es exponencial a la supervivencia del vector. El control biológico es una manera efectiva de reducir o mitigar plagas a través del uso de agentes naturales, y es más amigable para el ambiente que los tratamientos tradicionales con insecticidas químicos. Sin embargo, hay muy poca información sobre el control biológico de flebótomos y potenciales agentes de control. En el laboratorio donde se desarrolló esta tesis, recientemente se utilizó la pirosecuenciación para analizar los taxones asociados a <i>Lu. longipalpis</i> de zonas endémica (ZE) y no endémica (ZNE) de LV en Argentina y Brasil, respectivamente (McCarthy et al., 2011), y para comparar los transcriptomas de estos especímenes (McCarthy et al., 2013). Estos análisis permitieron ensamblar un inventario abarcativo de los taxones asociados a <i>Lu. longipalpis</i> adultos de ZE y ZNE de LV, y proveyó el fundamento para analizar la significancia de posibles candidatos para el control biológico de este vector (McCarthy et al., 2011; McCarthy et al., 2013). En este contexto, el objetivo general de la presente tesis consistió en establecer la significancia de los taxones previamente encontrados en <i>Lu. longipalpis</i> adultos (entre ellos, protistas, hongos y bacterias) (McCarthy et al., 2011), con particular énfasis en los posibles agentes de control biológico y en los agentes etiológicos de importancia médica y veterinaria. Con este fin, se diseñaron y evaluaron cebadores diagnósticos para confirmar la presencia y asociación de los taxones identificados.