Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is a cytokine used to treat neutropenia. Different glycosylated and non-glycosylated variants of G-CSF for therapeutic application are currently generated by recombinant expression. Here, we describe our approaches to establish a first semisynthesis strategy to access the aglycone and O-glycoforms of G-CSF, thereby enabling the preparation of selectively and homogeneously post-translationally modified variants of this important cytokine. Eventually, we succeeded by combining selenocysteine ligation of a recombinantly produced N-terminal segment with a synthetic C-terminal part, transiently equipped with a side-chain-linked, photocleavable PEG moiety, at low concentration. The transient PEGylation enabled quantitative enzymatic elongation of the carbohydrate at Thr133. Overall, we were able to significantly reduce the problems related to the low solubility and the tendency to aggregate of the two protein segments, which allowed the preparation of four G-CSF variants that were successfully folded and demonstrated biological activity in cell proliferation assays.

Der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) ist ein Zytokin, das zur Behandlung von Neutropenie eingesetzt wird. Unterschiedlich glykosylierte und nicht glykosylierte Varianten von G-CSF werden für therapeutische Anwendungen derzeit durch rekombinante Expression hergestellt. Im Folgenden beschreiben wir unsere Herangehensweise zur Etablierung einer ersten Semisynthesestrategie für die Synthese des Aglykons und verschiedener O-Glykoformen von G-CSF, um die Herstellung von selektiv und homogen posttranslational modifizierten Varianten dieses wichtigen Zytokins zu ermöglichen. Letztendlich erreichten wir dies, durch die Selenoesterligation eines rekombinant hergestellten N-terminalen Segments mit einem synthetisch hergestellten C-terminalen Segment, welches vorübergehend mit einer lichtabspaltbaren Polyethylenglykol-(PEG) Gruppe an einer Seitenkette versehen wurde, bei niedrigen Konzentrationen. Die transiente PEGylierung ermöglichte dabei die quantitative enzymatische Verlängerung des Kohlenhydrates an Thr133. Insgesamt ist es uns gelungen, die Syntheseherausforderungen auf Grund der niedrigen Löslichkeit und der Aggregationstendenz der zwei Proteinsegmente, signifikant zu reduzieren. Dies ermöglichte uns die Herstellung von vier G-CSF Varianten, die erfolgreich gefaltet wurden und in Zellproliferationsexperimenten biologische Aktivität zeigten.