Akar kuning (Fibraurea tinctoria Lour.) merupakan tumbuhan khas yang dapat dijumpai di Kalimantan serta biasa dimanfaatkan oleh masyarakat setempat sebagai obat gatal, penyakit kuning dan diare. Salah satu senyawa kimia yang terkandung dalam akar kuning adalah berberin yang berpotensi memiliki khasiat sebagai antidiabetes, antivirus, antibakteri dan antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi tumbuhan Akar Kuning (Fibraurea tinctoria Lour.) sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan menggunakan metode disc diffusion. Ekstrak etanol difraksinasi dengan menggunakan pelarut n-heksan dan etilasetat, ekstrak dan fraksi yang telah didapat ditimbang dengan konsentrasi 2,5%, 5% dan 10%. Kontrol positif yang digunakan yaitu amoxicillin dan DMSO sebagai kontrol negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ektrak etanol dan fraksi akar kuning (Fibraurea tinctoria Lour.) memiliki potensi untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Aktivitas zona hambat terbesar yang terbentuk pada ekstrak etanol yaitu pada konsentrasi 10% dengan diameter zona hambat 9,18 mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 12,16 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus sedangkan fraksi batang akar kuning yang memiliki aktivitas antibakteri paling kuat terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yaitu fraksi sisa. Staphylococcus aureus memiliki sensitifitas lebih tinggi terhadap akar kuning (Fibraurea tinctoria Lour.) dari pada bakteri Escherichia coli.