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ZUSAMMENFASSUNG Ziel: Die photodynamische Therapie kann eine alternative Behandlungsmethode bei antibiotikaresistenten Keratitiden darstellen. In dieser Studie wurde die Wirkung der photodynamischen Therapie mit Bengalrosa (RB-PDT) auf die Viabilität und Proliferation von humanen limbalen Epithelstammzellen (T-LSCs), humanen Hornhautepithelzellen (HCE-T), limbalen Fibroblasten (LFCs), normalen und Keratokonus-Fibroblasten (HCFs und KC-HCFs) „in vitro“ untersucht. Material und Methoden: Für die Experimente an den limbalen Epithelstammzellen wurden 2 verschiedene Zelllinien (T-LSCs und HCE-T) verwendet. Die primären LFCs und HCFs wurden aus den Korneoskleralringen von Hornhautspendern, die KC-HCFs aus perforierenden Keratoplastiken von Keratokonus-Patienten isoliert und kultiviert (jeweils n=5). Die RB-PDT wurde mit einer 0,001% igen RB-Konzentration bei einer Wellenlänge von 565 nm und einer Energiedosis von 0,14 bis 0,7 J/cm2 durchgeführt. Zur Bestimmung der Viabilität wurde 24 Stunden nach der Bestrahlung der XTT-, zur Bestimmung der Proliferation der BrdU-Assay verwendet. Ergebnisse: Die ausschließliche Verwendung von RB oder Bestrahlung hatten keinen messbaren Einfluss auf die Viabilität oder Proliferation der unterschiedlichen Zelltypen (p≥0,1). Unter Verwendung der RB-PDT mit einer Dosis von 0,17 J/cm2 sank die Viabilität jedoch in den HCFs (p < 0,001) und KC-HCFs (p < 0,0001), und bei einer Dosis von 0,35 J/cm2 in den T-LSCs (p < 0,001), HCE -T (p < 0,05) und LFCs (p < 0,0001). Die Zellproliferation verringerte sich signifikant ab einer Dosis von 0,14 J/cm2 in T-LSCs (p < 0,0001), HCE-T (p < 0,05) und KC- HCFs (p < 0,001) und ab einer Dosis von 0,17 J/cm2 Fluenz in HCFs (p < 0,05). Für die Proliferationsbestimmung der LFCs konnten mit dem BrdU-Assay keine Werte ermittelt werden. Schlussfolgerung: Die RB-PDT zeigt eine dosisabhängige Phototoxizität auf Hornhautepithel- und Stromazellen. Die in dieser Studie ermittelten Daten und experimentellen Parameter bieten eine verlässliche Referenz für zukünftige Untersuchungen für die photodynamische Therapie mit Bengalrosa. Abstract Purpose: To investigate the effect of Rose Bengal photodynamic therapy (RB-PDT) on viability and proliferation of human limbal epithelial stem cells (T-LSCs), human corneal epithelial cells (HCE-T), human limbal fibroblasts (LFCs), human normal and keratoconus fibroblasts (HCFs and KC-HCFs), in vitro. Methods: T-LSCs and HCE-T cell lines were used in this research. LFCs were isolated from healthy donor corneal limbus (n=5), HCFs from healthy human donor corneas (n=5), and KC-HCFs from penetrating keratoplasties of keratoconus patients (n=5). After cell culture, RB-PDT was performed using 0.001% RB concentration and 565 nm wavelength illumination, with 0.14 to 0.7 J/cm2 fluence. The XTT and the BrdU assays were used to assess cell viability and proliferation, 24 hours after RB-PDT. Results: Rose Bengal or illumination alone did not change cell viability or proliferation in any of the cell types (p≥0.1). However, following RB-PDT, viability decreased significantly from 0.17 J/cm2 fluence in HCFs (p<0.001) and KC-HCFs (p<0.0001), from 0.35 J/cm2 fluence in T-LSCs (p<0.001), HCE-T (p<0.05) and LFCs ((p<0.0001), respectively. Cell proliferation decreased significantly from 0.14 J/cm2 fluence in T-LSCs (p<0.0001), HCE-T (p<0.05), and KC-HCFs (p<0.001) and from 0.17 J/cm2 fluence in HCFs (p<0.05). Regarding LFCs proliferation, no values could be determined by the BrdU assay. Conclusions: Though RB-PDT seems to be a safe and effective treatment method in vivo, its dose-dependent phototoxicity on corneal epithelial and stromal cells has to be respected. The data and the experimental parameters applied in this study may provide a reliable reference for future investigations.

Purpose: To assess various potential factors on human limbal epithelial cell (LEC) outgrowth in vitro, using corneal donor tissue following long-term storage (organ culture) and a stepwise linear regression algorithm. Methods: Three-hundred and four corneoscleral rings of 215 donors have been used for our experiments. For digestion of the limbal tissue and isolation of the limbal epithelial cells, the tissue pieces were incubated with 4.0 mg/ml collagenase A at 37°C with 95% relative humidity and 5% CO2 atmosphere overnight. Thereafter, limbal epithelial cells were separated from limbal keratocytes using a 20 µm CellTricks filter. The separated human LECs were cultured in KSFM medium, 1% penicillin/streptomycin (P/S), 0.02% epidermal growth factor (EGF) and 0.3% bovine pituitary extract (BPE). The potential effect of donor age (covariate), postmortem time (covariate), medium time (covariate), size of the used corneoscleral ring (360º, 270º 180º, 120º, 90º, less than 90º) (covariate), endothelial cell density (ECD) (covariate), gender (factor), number of culture medium changes during organ culture (factor) and origin of the donor (donating Institution and storing Institution, factor) on the limbal epithelial cell outgrowth was analyzed with a stepwise linear regression algorithm. Results: The rate of successful human LEC outgrowth was 37.5%. From the stepwise linear regression algorithm we found out that the relevant influencing parameters on the LEC growth were: intercept (p<0.001), donor age (p=0.002), number of culture medium changes during organ culture (p<0.001), total medium time (p=0.181), size of the used corneoscleral ring (p=0.007), as well as medium time ‧ size of the corneoscleral ring (p=0.007). Conclusions: The success of LEC outgrowth increases with lower donor age, lower number of organ culture medium changes during storage, shorter medium time in organ culture and smaller corneoscleral ring size. Our stepwise linear regression algorithm may help us in optimizing LEC culture, in vitro. Keywords: limbal epithelial cell culture, organ culture, stepwise linear regression algorithm ABSTRAKT Hintergrund: Um verschiedene potentielle Faktoren auf das Wachstum humaner limbaler Epithelzellen (LEC) aus Hornhautspendergewebe nach Langzeitlagerung (Organkultur) in vitro zu untersuchen, wurde ein schrittweiser linearer Regressionsalgorithmus verwendet. Methoden: Für unsere Experimente wurden dreihundertvier Hornhautringe von 215 Spendern verwendet. Zunächst wurden die Gewebestücke mit 4,0 mg/ml Kollagenase A bei 37°C mit 95% relativer Luftfeuchtigkeit und 5% CO2-Atmosphäre über Nacht inkubiert. Danach wurden die limbalen Epithelzellen mit Hilfe eines 20 µm CellTricks-Filters von den limbalen Keratozyten getrennt. Die humanen LECs wurden in KSFM-Medium, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 0,02% epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und 0,3% Rinderhypophysenextrakt (BPE) kultiviert. Der potenzielle Einfluss des Spenderalters (Kovariate), der postmortalen Zeit (Kovariate), des Mediums (Kovariate), der Größe des verwendeten korneoskleralen Rings (360º, 270º 180º, 120º, 90º, weniger als 90º) (Kovariate), der Endothelzelldichte (ECD) (Kovariate), Geschlecht (Faktor), Anzahl der Kulturmediumwechsel während der Organkultur (Faktor) und Herkunft des Spenders (spendende Institution und aufbewahrende Institution, Faktor) auf das Wachstum der LEC wurde mit einem schrittweisen linearen Regressionsalgorithmus analysiert. Ergebnisse: Die Rate der erfolgreichen Kultivierung humaner LEC betrug 37,5%. Die mit dem schrittweisen linearen Regressionsalgorithmus berechneten relevanten Einflussparameter auf das LEC-Wachstum waren: Intercept (p<0,001), Spenderalter (p=0,002), Anzahl der Kulturmediumwechsel während der Organkultur (p<0,001), Gesamtmediumzeit (p=0,181), Größe des verwendeten korneoskleralen Rings (p=0,007), sowie Mediumzeit ‧ Größe des korneoskleralen Rings (p=0,007). Schlussfolgerungen: Der Erfolg der LEC Kultivierung steigt mit dem abnehmendem Alter des Spenders, der geringeren Anzahl von Wechseln des Organkulturmediums während der Lagerung, der kürzeren Mediendauer in der Organkultur und der kleineren Größe des korneoskleralen Rings. Dieser, von uns berechneter schrittweiser linearer Regressionsalgorithmus kann uns bei der Optimierung der LEC-Kultur in vitro helfen. Schlüsselwörter: Limbale Epithelzellkultur, Organkultur, schrittweiser linearer Regressionsalgorithmus