Foi avaliado o nível de conhecimento de médicos e enfermeiros obstetras sobre a utilização de ácido fólico (AF) para a prevenção dos defeitos do fechamento do tubo neural (DFTN). Estudo descritivo transversal no qual 118 voluntários (95 médicos e 23 enfermeiros), responderam um questionário com 21 perguntas sobre a prevenção dos DFTN. Os dados foram analisados em função do conhecimento relatado, das recomendações preconizadas pelo Ministério da Saúde (MS) e das evidências científicas (EC) disponíveis sobre o assunto investigado. O nível de conhecimento baseado nas EC e nas recomendações do MS foi diferente (4,64 ± 0,20 vs 5,55 ± 0,15; p < 0,001; Média ± EPM). Não houve diferença entre o nível de conhecimento quando comparado à formação dos mesmos, ao tempo que realizam atendimento pré-natal e entre as duas classes de profissionais avaliados. Houve diferença entre o nível de conhecimento relatado e o baseado nas EC (6,76 ± 0,18 vs 4,64 ± 0,15; p < 0,001) e o baseado nas recomendações do MS (6,76 ± 0,18 vs 5,55 ± 0,20; p < 0,001), 94,1% dos profissionais conhecem o papel do ácido fólico, contudo, 64,2% relataram não saber quando iniciar a suplementação no pré-natal. Frente ao exposto foi verificado que a grande maioria dos avaliados relatou conhecer a importância do AF na prevenção do DFTN, porém, existe ainda desconhecimento sobre o assunto investigado.