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A photocleavable energy-transfer dyad was synthesized, characterized, and applied to single-molecule fluorescence microscopy. After photocleavage, a combination of independent two-color single-molecule tracking and analysis of single-molecule energy-transfer efficiencies allows the determination of the temporal evolution of the relative distances between both fragments from the nm to the μm scale. This gives access to a broad range of diffusion coefficients.

Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie eignen sich vorzüglich zur Untersuchung der Struktur und Dynamik biologischer und materialwissenschaftlicher Systeme. [1][2][3] Einer der Gründe ihres Erfolgs beruht auf der Mçg-lichkeit, einzelne Moleküle mit einer Genauigkeit unterhalb der Beugungsgrenze von Licht lokalisieren [4,5] und die damit ermittelten Positionen zu Trajektorien verbinden zu kçnnen.[6] Damit ermçglicht Weitfeldfluoreszenzmikroskopie die parallele Verfolgung von Einzelmolekülbewegung. [7] Bisher wurden zur Analyse absolute Molekülpositionen verwendet.[8] Aus diesem Grund wurde die Genauigkeit der Einzelmolekül-Bewegungsanalyse durch das Signal-zuRausch-Verhältnis des Fluoreszenzsignals, Fluoreszenzhintergrund, [9] Molekülorientierung [10] und die mechanische Stabilität des optischen Aufbaus während der Messung beschränkt. Darüber hinaus hängt die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten über Einzelmolekülverfolgung stark von den experimentellen Parametern ab, [11] was zu signifikanten Ungenauigkeiten führen kann.[8] Obwohl unter optimalen experimentellen Bedingungen über eine Lokalisierung mit Nanometergenauigkeit berichtet wurde, [12,13] wird diese Genauigkeit in den meisten praxisrelevanten Systemen nicht erreicht, da sie eine Hintergrundfluoreszenz aufweisen und ihnen die nçtige Langzeitstabilität fehlt. Einige der genannten Probleme kçnnen gelçst werden, wenn die Positionen relativ zu einem internen Bezugspunkt bestimmt werden. Dieses Konzept wird im Folgenden beschrieben.Hier [14] wurden bereits in der Literatur beschrieben, [15][16][17][18] aber ihre Verknüpfung über eine photospaltbare Gruppe ist neu. Die Absorptions-und Emissionsspektren von 1 und den einzelnen Chromophoren in Cyclohexan befinden sich in den Hintergrundinformationen.In Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge und somit der Wahrscheinlichkeit der drei Chromophore, Licht zu absorbieren, beobachtet man für die Dyade 1 unterschiedliches photophysikalisches und photochemisches Verhalten. Bei Anregung mit langen Wellenlängen über 600 nm wird ausschließlich der TDI-Chromophor angeregt, und das Intensitätsmaximum der Fluoreszenz liegt bei 699 nm, im Vergleich zum TDI-Farbstoff 3 um 18 nm bathochrom verschoben (Struktur und Spektrum befinden sich in den Hintergrundinformationen). Licht mit einer Wellenlänge unter 600 nm kann sowohl vom PDI-als auch vom TDI-Chromophor absorbiert werden. Aufgrund der Energieübertragung wird jedoch, selbst nach Anregung des PDI-Chromophors, das Fluoreszenzspektrum eindeutig von der TDI-Emission dominiert. Unter der Annahme eines Fçrster-ResonanzEnergieübertragungsmechanismus (FRET), ergibt sich für die Abhängigkeit der Energieübertragungseffizienz h von der Schema 1. Die in dieser Arbeit synthetisierte und verwendete photospaltbare Fluoreszenzfarbstoffdyade 1. Ein Perylendiimid-Chromophor dient als Energiedonor, ein Terrylendiimid-Chromophor als Energieakzeptor. Beide Hälften sind über eine photolabile MethylphenacylBrücke miteinander verknüpft.