En este estudio se estandarizó y validó la técnica de PCR anidada para la detección rápida, sensible y confiable de especies del género Xyleborus mediante el uso de los “primers” externos CI-J-2183 y TL2-N-3014 e internos J2210 y N2739, que amplifican una banda de 500 pb de la región del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa subunidad 1(CO1). Asimismo, se realizó la extracción de ADN de 26 ejemplares de Xyleborus con el kit Qiagen DNeasy® mericom Food (DMF), no reportado previamente su uso para su aplicación en insectos, que resultó en ADN suficiente y de alta calidad para reacciones de amplificación por PCR. El método permitió procesar un solo insecto por extracción, y obtener material genético de muestras conservadas en alcohol de hasta ocho años de antigüedad. El límite de detección se definió hasta una concentración de 780 pg/μl. Se optimizóla PCR en un volumen final de 15 μL sin comprometer calidad de la amplificación. La técnica estandarizada permitió la obtención de ADN de calidad, lo que aseguró alta reproducibilidad y sensibilidad en la detección de especies de Xyleborus y la secuenciación parcial del gen CO1 para las siete especies estudiadas; las secuencias consenso fueron analizadas por homología y depositadas en el GenBank.