El brócoli es una de las hortalizas de mayor importancia económica en México, y una de las enfermedades que reduce su rendimiento y calidad es la pudrición del florete, la cual se ha asociado a diferentes fitopatógenos. El objetivo del presente trabajo fue identificar morfológica y molecularmente a los agentes causales de la pudrición del florete en el cultivo de brócoli en México. Se colectaron floretes con síntomas de pudrición en diferentes municipios del estado de Guanajuato (León, San Francisco del Rincón, Valle de Santiago, Abasolo, Juventino Rosas y Dolores Hidalgo). Los aislados obtenidos se identificaron con base en sus características culturales, morfológicas y molecularmente (mediante PCR-ITS) como Alternaria alternata (AA), Fusarium oxysporum (FO) y Fusarium verticillioides (FV). La patogenicidad de estas especies fúngicas se corroboró mediante los postulados de Koch. La frecuencia de aislamiento de los hongos fue de 55, 26 y 19 % para AA, FV y FO, respectivamente, del total de muestras analizadas. La secuencia obtenida de un aislado representativo de cada hongo se comparó con las reportadas en el banco de genes del NCBI, donde los mayores porcentajes de similitud fueron 99.6, 98.9 y 98.2 % para FO, FV y AA, respectivamente, con lo cual se confirmaron los resultados de la identificación morfológica. Este es el segundo reporte de la presencia de AA y FO asociados a la pudrición del florete de brócoli en México, y el primer reporte de FV como parte del complejo de agentes causales de esta enfermedad.