Se evaluó el efecto del medio de cultivo y tiempo de pre-incubación para reactivar inóculo ruminal preservado, evaluando parámetros de la cinética de fermentación y digestibilidad in vitro de materia seca (DIVMS). En el primer experimento, los tratamientos fueron 1) CONTROL, líquido ruminal fresco; 2) BAJO24, inóculo reactivado pre-incubándolo durante 24 h en una solución base; 3) MODE24, inóculo reactivado pre-incubándolo durante 24 h en una solución base, extracto de levaduras y peptona de caseína; y 4) ALTO24, inóculo reactivado pre-incubándolo durante 24 h en una solución base, extracto de levaduras, peptona de caseína y carbohidratos. En el segundo experimento, los tratamientos fueron 1) CONTROL, líquido ruminal fresco, y 2) ALTO12, similar a ALTO24, pero el inóculo fue pre-incubado durante 12 h. Se realizaron tres réplicas. Se midió el volumen máximo de gas (Vm), la fase lag (L), la tasa de producción de gas (S) y DIVMS usando cuatro substratos. Se analizaron los efectos principales de inóculos y substratos e interacciones. Comparado con el CONTROL, la preservación del inóculo afectó (P<0.01) Vm, L y S. Sin embargo, ALTO24 mejoró (P<0.01) la cinética de fermentación y DIVMS comparado con el tratamiento MODE24 o BAJO24. En el segundo experimento, DIVMS fue menor (P<0.01) para el tratamiento ALTO12 a las 72 h de fermentación comparado con el CONTROL. La alfalfa y el pasto ovillo tuvieron mayor (P<0.01) Vm y DIVMS comparado con el cocuite y el pasto de Guinea. La reactivación del inóculo ruminal preservado por pre-incubación durante 24 h en medio que contiene extracto de levaduras, peptona de caseína y carbohidratos tuvo un desempeño mejor que la pre-incubación por 12 h; sin embargo, la cinética de fermentación y DIVMS no fueron comparables al líquido ruminal fresco.