The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides an excellent model to study mechanisms of transcription factor-induced global alterations of the epigenome and genome function. Here, we have investigated the early transcriptional events of cellular reprogramming triggered by the co-expression of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (OSKM) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and mouse hepatocytes (mHeps). In this analysis, we identified a gene regulatory network composed of nine transcriptional regulators (9TR; Cbfa2t3, Gli2, Irf6, Nanog, Ovol1, Rcan1, Taf1c, Tead4, and Tfap4), which are directly targeted by OSKM, in vivo. Functional studies using single and double shRNA knockdowns of any of these factors caused disruption of the network and dramatic reductions in reprogramming efficiency, indicating that this network is essential for the induction and establishment of pluripotency. We demonstrate that the stochastic co-expression of 9TR network components occurs in a remarkably small number of cells, approximating the percentage of terminally reprogrammed cells as a result of dynamic molecular events. Thus, the early DNA-binding patterns of OSKM and the subsequent probabilistic co-expression of essential 9TR components in subpopulations of cells undergoing reprogramming steer the reconstruction of a gene regulatory network marking the transition to pluripotency.

Transcription factor-induced reprogramming of somatic cells to pluripotency is mediated via profound alterations in the epigenetic landscape. The histone variant macroH2A1 (mH2A1) is a barrier to the cellular reprogramming process. We demonstrate here that mH2A1 blocks reprogramming and contributes to the preservation of cell identity by trapping cells at the very early stages of the process, namely, at the mesenchymal-to-epithelial transition (MET). We provide a comprehensive analysis of the genomic sites occupied by the mH2A1 nucleosomes in human fibroblasts and embryonic stem (ES) cells and how they affect the reprogramming of fibroblasts to pluripotency. We have integrated chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) data with transcriptome sequencing (RNA-seq) data using cells containing reduced levels of mH2A1 and have inferred mH2A1-centered gene-regulatory networks that support the fibroblast and ES cell fates. We found that the exact positions of mH2A1 nucleosomes in regulatory regions of specific network genes with key regulatory roles guarantee the functional robustness of the regulatory networks. Using the reconstructed networks, we can predict and validate several components and their interactions in the establishment of stable cell types by limiting progression to alternative cell fates.

SUMMARY In the present study, we investigated the induction of the p38-MAPK signalling pathway by copper, as exemplified by CuCl2, in the isolated perfused heart of the amphibian Rana ridibunda. We found that p38-MAPK phosphorylation by CuCl2 occurs in a dose-dependent manner, with maximum activation (8.73±1.43-fold relative to control values) attained by perfusion with 500 μmol l–1CuCl2 for 15 min, while this activation sustained even after 60 min of reperfusion with normal bicarbonate buffer. CuCl2 also induced the phosphorylation of the small heat shock protein 27 (Hsp27) in a p38-MAPK dependent manner, as revealed by experiments using the p38-MAPK inhibitor SB203580. p38-MAPK and Hsp27 phosphorylations were also strongly induced by hyperthermia (42°C), while the simultaneous use of hyperthermia and CuCl2 had a synergistic effect on p38-MAPK activation. Furthermore,perfusions with the potent antioxidant L-ascorbic acid (100 μmol l–1), the antioxidant enzymes catalase (CAT) (150 U ml–1) or superoxide dismutase (SOD) (30 U ml–1) in the presence of 500 μmol l–1CuCl2 did not attenuate the CuCl2-induced p38-MAPK activation, implying that at least the reactive oxygen species (ROS) scavenged by these agents are not implicated in this kinase activation. The p38-MAPK phosphorylation induced by the combined action of CuCl2 and hyperthermia was partially inhibited by catalase, indicating that hyperthermia possibly activates the kinase through the production of H2O2. Caspase-3, an effector protease of apoptosis,remained inactive in hearts perfused at normal or hyperthermic conditions, in the absence or presence of 500 μmol l–1 CuCl2. All the above results suggest that, in the amphibian Rana ridibundaheart, p38-MAPK activation by copper has a possible protective role through the small Hsp27.

Generation of induced pluripotent stem cells from specialized cell types provides an excellent model to study how cells maintain their stability, and how they can change identity, especially in the context of disease. Previous studies have shown that chromatin safeguards cell identity by acting as a barrier to reprogramming. We investigated mechanisms by which the histone macroH2A variants inhibit reprogramming and discovered that they work as gate keepers of the mesenchymal cell state by blocking epithelial transition, a step required for reprogramming of mouse fibroblasts. More specifically, we found that individual macroH2A variants regulate the expression of defined sets of genes, whose overall function is to stabilize the mesenchymal gene expression program, thus resisting reprogramming. We identified a novel gene network (MSCN, mesenchymal network) composed of 63 macroH2A-regulated genes related to extracellular matrix, cell membrane, signaling and the transcriptional regulators Id2 and Snai2, all of which function as guardians of the mesenchymal phenotype. ChIP-seq and KD experiments revealed a macroH2A variant-specific combinatorial targeting of the genes reconstructing the MSCN, thus generating robustness in gene expression programs to resist cellular reprogramming.

Ο επαγώμενος από τους μεταγραφικούς παράγοντες κυτταρικός επαναπρογραμματισμός στην πολυδύναμη κατάσταση απαιτεί ριζικές αλλαγές στο επιγενετικό τοπίο των σωματικών κυττάρων καθιστώντας την όλη διαδικασία εξαιρετικά αναποτελεσματική. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι η macroH2A1.2 (mH2A1.2), μία ασυνήθιστη ιστονική ποικιλομορφή που απαντά μόνο στα σπονδυλωτά με υψηλό βαθμό συντήρησης, δρα ως εμπόδιο στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό των σωματικών κυττάρων τόσο του ποντικού όσο και του ανθρώπου. Μέχρι στιγμής, η mH2A1.2 ήταν συνδεδεμένη με την αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, σε πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας αποδείχθηκε ότι τα mH2A1.2-μονονουκλεοσώματα απαντούν στο σημείο έναρξης της μεταγραφής (TSS) σε υποσύνολο τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων με ειδικό για τον κάθε κυτταρικό τύπο τρόπο καθώς επίσης ότι η στρατηγική θέση και σταθεροποίηση αυτών σε συγκεκριμένους υποκινητές γονιδίων ανθρώπου ορίζουν εύρωστα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Επομένως, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού και ο προσδιορισμός του ρόλου της mH2A1.2 σε αυτή τη διαδικασία κατά τη μελέτη κυττάρων ανθρώπου. Για το σκοπό αυτό, πρώτο βήμα της μελέτης ήταν ο σχεδιασμός μεθοδολογίας γένεσης επαγώμενων πολυδύναμων κυττάρων (iPSCs) ανθρώπου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η στοιχειομετρία των παραγόντων επαναπρογραμματισμού, Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM), είναι σημαντική για τον επαναπρογραμματισμό, κατασκευάστηκε ένας επαγώμενος από δοξικυκλίνη λεντιϊκός φορέας που φέρει την κασέτα έκφρασης και των τεσσάρων παραγόντων. Ως εκ τούτου, η ισχυρή επίδραση του κάθε κυτταρικού τύπου στην ικανότητα να επαναπρογραμματίζονται, συμπεριλαμβάνοντας την αποτελεσματικότητα και την κινητική της διαδικασίας, προσδιορίστηκε κατά τη μελέτη τριών διακριτών κυτταρικών τύπων ανθρώπου μεσοδερμικής προέλευσης. Επιπλέον, κυτταρικές σειρές iPS ανθρώπου που επαληθεύτηκαν για την πολυδυναμία και την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς τύπους δημιουργήθηκαν από ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου καθότι απομονώνονται εύκολα με βιοψία από το δέρμα υγειών εθελοντών και ασθενών ενώ αποτελούν το πιο κοινό κυτταρικό τύπο για τη γένεση iPSCs και την εφαρμογή τους σε θεραπευτικές προσεγγίσεις. Δεύτερο βήμα της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των φαινοτυπικών και των μεταγραφικών αλλαγών κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό ινοβλαστών ανθρώπου και σύγκριση με τα αποτελέσματα που προέρχονται από την αντίστοιχη μελέτη στο ποντίκι. Οι ομοιότητες που τονίζονται από τα αποτελέσματα της παρούσας ανάλυσης επιβεβαιώνουν ότι η διαδικασία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού είναι συντηρημένη μεταξύ των δύο οργανισμών ακόμη κι αν εμφανίζουν διαφορετική κινητική και αποτελεσματικότητα. Τέλος, τρίτο βήμα της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλο της mH2A1.2 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού των ινοβλαστών ανθρώπου. Ακόμη κι αν ο κατασταλτικός της ρόλος έχει προσδιοριστεί στα κύτταρα του ποντικού και στα κερατινικά κύτταρα του ανθρώπου ο υποκείμενος μηχανισμός με τον οποίο η mH2A1.2 μπλοκάρει αυτή τη διαδικασία παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα εργασία επιβεβαιώθηκε ο κατασταλτικός της ρόλος και στους ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου. Αξιοσημείωτο είναι ότι το αρχικό επίμηκες σχήμα των κυττάρων διατηρείται κατά την υπερέκφραση της mH2A1.2 υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα παγιδεύονται στα πρώιμα στάδια της διαδικασίας όταν λαμβάνει χώρα η ΜΕΤ καθότι εμποδίζεται η ενεργοποίηση της έκφραση της E-CAD. Αντίθετα, η μεταγραφική εναλλαγή της N-CAD στην E-CAD διευκολύνεται κατά την αποσιώπηση αυτής. Από την αλληλούχιση των DNA θραυσμάτων της ανοσοκατακρημνισμένης χρωματίνης (ChIP-seq) σε συνδυασμό με το μεταγραφικό προφίλ που είχε προηγούμενα ταυτοποιηθεί (RNA-seq) στους ινοβλάστες ανθρώπου και στα ESCs ανθρώπου, νέα δεδομένα προκύπτουν για το μηχανισμό με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον επαναπρογραμματισμό. Καταρχήν, επιβεβαιώθηκε ότι ο μηχανισμός εναπόθεσης των mH2A1.2–νουκλεοσωμάτων είναι ειδικός για τον κάθε κυτταρικό τύπο του ίδιου οργανισμού αλλά εξελικτικά συντηρημένος για τον ίδιο κυτταρικό τύπο μεταξύ διαφορετικών ειδών όπως προέκυψε από τη σύγκριση με το ποντίκι. Επιπλέον, επαληθεύτηκε η ευρεία γενομική κατανομή των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στο TSSs υποσυνόλου τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων. Αξιοσημείωτη όμως είναι η παρουσία των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στα μη-εκφραζόμενα γονίδια στους ινοβλάστες ανθρώπου χωρίς να εμφανίζει ιδιαίτερη προτίμηση εντοπισμού σε συγκεκριμένες γονιδιακές θέσεις, ενώ στα ESCs ανθρώπου στα εκφραζόμενα γονίδια με μεγάλη συχνότητα εντοπισμού σε περιοχές που εκτείνονται γύρω από το TSS. Περαιτέρω εξέταση των DNA αλληλουχίων που υπόκεινται στις θέσεις εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων αποκάλυψε ότι στους ινοβλάστες ανθρώπου τα mH2A1.2-νουκλεοσώματα καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης ενεργοποιητών στα μη-εκφραζόμενα γονίδια, ενώ στα εκφραζόμενα γονίδια καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης καταστολέων. Αντίθετα, στα ESCs ανθρώπου, δεν παρατηρήθηκε κάποιος συγκεκριμένος DNA κώδικας στις αντίστοιχες θέσεις εντοπισμού. Ωστόσο, η παρουσία αυτών κυρίως γύρω από το TSS των ενεργών γονιδίων υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο τους στην άριστη ρύθμιση της μεταγραφής. Καθότι οι πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό λειτουργίας των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων δεν ερμηνεύουν επαρκώς τον τρόπο με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό, σχεδιάστηκαν γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα (GRNs) ειδικά για τον κάθε κυτταρικό τύπο που εστιάζουν στους στόχους της mH2A1.2 βασισμένα σε πειραματικά επαληθευμένες αλληλεπιδράσεις ενσωματώνοντας τα αποτελέσματα της RNA-seq ανάλυσης. Οι αναπαραστάσεις των GRNs υποστηρίζουν το κυτταρικό φαινότυπο των ινοβλαστών ανθρώπου και των ESCs ανθρώπου τα οποία καθιερώνονται και διατηρούνται από την παροδική ρύθμιση και δυναμική των δικτύων των συ-ρυθμιζόμενων γονιδίων ενώ αποδεικνύεται ότι η στρατηγική θέση εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων σε ρυθμιστικά γονίδια με ρόλο «κλειδί» μειώνει τη μεταβλητότητα στη γονιδιακή έκφραση παρά την εκτεταμένη διασταυρούμενη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφόρων παραγόντων που διαταράσσουν το φυσιολογικό σύστημα. Συνεπώς, η mH2A1.2 φαίνεται να προστατεύει την απόφαση του κυττάρου περιορίζοντας τη μετάβαση σε εναλλακτικές κυτταρικές μορφές.