Objetivo. Determinar la presencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) mediante métodos serológicos, microbiológicos y moleculares, para genotipar los aislamientos de MAP y explorar factores asociados a la seropositividad a MAP en un hato de búfalos del departamento de Antioquia (Colombia). Materiales y métodos. Se realizó un estudio transversal para analizar muestras fecales y de suero de 21 búfalas adultas asintomáticas mediante cultivo y ELISA, respectivamente. Los cultivos aislados sospechosos se confirmaron mediante PCR de MAP-IS900 (IS900-PCR). El ADN positivo se volvió a analizar mediante PCR cuantitativo de MAP-IS900 (IS900-qPCR), y luego, se subtipificó utilizando unidades repetitivas intercaladas de micobacterias-número variable de repeticiones en tándem (MIRU-VNTR) y repetición de secuencia corta de múltiples locus (MLSSR). Resultados. Al muestreo, la edad promedio de los animales era de 4.7 años, el 90.5% (19/21) eran hembras y el 84.2% (16/19) estaban preñadas. El puntaje promedio de condición corporal fue 4.2 (escala de 1 a 5). La producción de leche promedio fue de 3.5 L/día/animal. No se detectaron animales seropositivos a MAP. Una hembra de los 21 búfalos fue positiva mediante cultivo fecal en la semana seis de incubación y luego se confirmó mediante IS900-PCR. El análisis de subtipado reveló que el aislado de MAP correspondía al genotipo INMV 3 por MIRU-VNTR. Conclusiones. Según el conocimiento de los autores, este es el primer diagnóstico y aislamiento de MAP en búfalos en Colombia y la primera vez que se encuentra un perfil INMV 3 de MAP en esta especie en el país.