Anticoagulant and preserving solutions are designed to maintain the viability of blood and blood components. Plastic bags used for human blood storage are classified as Class III product for health. The RDC No. 35 of June 12, 2014 is the legislation that describes the quality control of blood units in Brazil. According to the resolution of the physical and chemical tests to be performed on anticoagulants solutions is the determination of 5-hydroxymethylfurfural content (5-HMF), a highly toxic pollutant formed by thermal decomposition of glucose present in the solutions, which may lead the patient even to death, justifying the need for their control. This work aimed to optimize and validate the methodology for determining the 5-HMF as recommended by ANVISA and the Inmetro. The parameters analyzed in the analytical validation were: specificity, linearity, detection limit, quantification limit, accuracy, precision and robustness. The results showed that the method is very effective for determining the 5-hydroxymethylfurfural which culminated in their integration into technical regulations published in June 2014.Keywords: Analytical validation; liquid chromatography; quality control. ResumoAs soluções anticoagulantes e preservadoras têm o objetivo de manter a viabilidade do sangue e seus componentes. As bolsas plásticas utilizadas para armazenamento de sangue humano são classificadas como produto para saúde de classe III. A RDC n° 35 de 12 de junho de 2014 é a legislação que descreve o controle de qualidade das bolsas de sangue no Brasil. De acordo com esta resolução um dos ensaios físico-químicos que devem ser realizados em soluções anticoagulantes é a determinação do teor de 5-hidroximetilfurfural (5-HMF), um contaminante altamente tóxico formado pela decomposição térmica da glicose presente nas soluções, podendo levar o paciente até mesmo ao óbito, justificando a necessidade de seu controle. Este trabalho teve o objetivo de otimizar e validar a metodologia para determinação do 5-HMF conforme preconizado pela Anvisa e o Inmetro. Os parâmetros analisados na validação analítica foram: especificidade, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão, precisão e robustez. Os resultados encontrados comprovaram que o método é bastante eficaz para a determinação do 5-hidroximetilfurfural o que culminou com a sua inserção no regulamento técnico publicado em junho de 2014.Palavras-chave: Validação analítica; cromatografia líquida; controle de qualidade.