The retention and binding mechanisms in electrostatic interaction-based chromatography (ion-exchange chromatography) of PEGylated proteins (covalent attachment of polyethylene glycol chains to protein) were investigated using our previously developed model. Lysozyme and bovine serum albumin were chosen as model proteins. The retention volume of PEGylated proteins shifted to lower elution volumes with increasing PEG molecular weight compared with the non-modified (native) protein retention volume. However, PEGylation did not affect the number of binding sites appreciably. The enzyme activity of PEGylated lysozyme measured with a standard insoluble substrate in suspension decreased considerably, whereas the activity with a soluble small-molecule substrate did not drop significantly. These findings indicate that when a protein is mono-PEGylated, the binding site is not affected and the elution volume reduces due to the steric hindrance between PEGylated protein and ion-exchange ligand.

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Effect of pore size on the performance of ion-exchange monolith tube chromatography of large biomolecules was investigated. Radial flow 1 mL polymer based monolith tubes of different pore sizes (1.5, 2, and 6 μm) were tested with model samples such as 20 mer poly T-DNA, basic proteins, and acidic proteins (molecular weight 14 000-670 000). Pressure drop, pH transient, the number of binding site, dynamic binding capacity, and peak width were examined. Pressure drop-flow rate curves and dynamic binding capacity values were well correlated with the nominal pore size. While duration of the pH transient curves depends on the pore size, it was found that pH duration normalized on estimated surface area was constant, indicating that the ligand density is the same. This was also confirmed by the constant number of binding site values being independent of pore size. The peak width values were similar to those for axial flow monolith chromatography. These results showed that it is easy to scale up axial flow monolith chromatography to radial flow monolith tube chromatography by choosing the right pore size in terms of the pressure drop and capacity.

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Molecular dif fusion coef ficients are impor tant physical (transpor t) proper ties for designing various separation processes such as chromatography and dr ying. They are also used for understanding the size of molecules. Although several methods can be used for determining the molecular dif fusion coef ficient D m , the D m values for large (modified) proteins, DNA and bionanoparticles are not readily available. In this study, D m values of PEGylated proteins of various molecular weights were measured by using the Taylor dispersion analysis (TDA) method and dynamic light scattering (DLS). Both methods provided ver y similar D m values. However, as each method has its own characteristics, limitations and precautions, it is recommended to use both methods as complimentary methods for obtaining reliable D m values. 緒 言 拡散係数(分子拡散係数あるいは相互拡散係数)Dm は，拡散物質移動速度を記述する移動物性値であり , 吸 着 , 乾燥(脱着), 抽出 , クロマトグラフィーなどさま ざまな分離操作・装置の設計に必要である [1-4]．また， 拡散係数から計算される物質の大きさも物質のキャラ クタリゼーションに重要な情報である． 多くの分子の拡散係数 D m の値は便覧あるいは相関式 により求めることができるが [5,6]，必要とする条件で の値がみつからないことも多い．それゆえ，D m の実測 は依然として重要である．また，とくに分子量の大き いタンパク質や DNA，さらにはバイオナノ粒子の D m は，ほとんど報告されていない． 拡散係数の測定のために，さまざまな方法が開発され 使用されている．それらの原理は macroscopic な移動量 の測定(濃度分布測定，拡散移動量測定)と microscopic な分子の移動の測定の 2 種類に大別される [7]． 本研究では，タンパク質および修飾タンパク質(PEG 化タンパク質)の D m を比較的単純な測定操作と装置が 簡 便 で あ る 細 管 内 層 流 速 度 分 布 を 利 用 し た Taylor 法 [8-12] と動的光散乱法 [7] で測定した．信頼できる値 を精度よく測定するための，それぞれの方法の特徴と 問題点あるいは留意点について考察した． 2. 実験および解析方法 2.1 Taylor dispersion 法による拡散係数 D m の測 定 [8-12] 細管内層流速度分布を利用した Taylor dispersion 法 (以下 TDA)は Fig. 1 に示すような比較的単純な装置 で測定できる方法として知られており，さまざまな物 質の拡散係数 D m が決定されている [8-12]．また，分 子の会合の解析などにも使用されている． 少量のサンプルを細管にパルス状に注入し，応答曲 線のピーク時間 t R と分散σ 2 (＝標準偏差σの 2 乗)か ら次式で拡散係数 D m を決定する． 2 R 2 c m 96 t d D = (1) ここで，d c は細管内径である．簡単な方法であるが， 得られた値が信頼できるかどうかについては，以下の 条件を検討しなければならない． 「日本食品工学会誌」 条件 1 遠心力による混合効果による影響 遠心力による混合効果を排除するためには下記の条 件を満足する必要がある． De・Sc 0.5 ＜10 (2) こ こ で，De と Sc は Dean 数 と Schmidt 数 で， そ れ ぞ れ次のように定義される． 2 1 coil c c De         = d d ud (3) m Sc D = (4) ρは溶媒の密度，u は溶媒の線速度， μは溶媒の粘度， d c は細管内径，d coil はコイル径である． 本 研 究 で 用 い た 細 管(d c ＝0.05 cm，L＝246.5 cm， d coil ＝7.0 cm) に 対 し て， 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン(Bovine serum albumin, BSA)の D m ＝0.67×10 -10 m 2 s -1 [20℃の 文献値を 25℃へ Stokes-Einstein 式 (7) から換算 ] を測 定するときに式 (2) を満たす条件を求めると，u＜10.98 cm/min でなければならない．体積流量では F v ＜0.0216 mL/min という非常に低流量となり，精密低流量ポン プが必要であることがわかる．より小さい値，例えば 要 旨 拡散係数(分子拡散係数あるいは相互拡散係数)D m は，クロマトグラフィーや乾燥などさまざまな分離操 作・装置の設計に必要な重要な物性値である．また， 物質の大きさを知るための重要な情報でもある．拡散 係数の測定のために，さまざまな方法が開発され使用 さ れ て い る が， と く に 分 子 量 の 大 き い タ ン パ ク 質 や DNA，さらにはバイオナノ粒子の D m は，ほとんど報 告されていない．本研究では，タンパク質および修飾 タンパク質(PEG 化タンパク質)の D m を比較的簡単 な測定操作と装置が簡便である細管内層流速度分布を 利用した Taylor 法と動的光散乱法で測定した．どちら の方法でもほぼ同じ D m 値を得ることができた． ただし， それぞれの方法には特徴と問題点があるので，よく理 解して相補的な方法として使用することが望ましい．