Daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urb) adalah salah satu tanaman yang dapat digunakan sebagai antibakteri. Daun pegagan memiliki kandungan kimia flavonoid, tanin dan saponin. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air dari daun pegagan serta untuk mengetahui Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari fraksi teraktif daun pegagan terhadap pertumbuhan Escherichia coli ATCC 25922. Serbuk daun pegagan dimaserasi menggunakan etanol 96%, kemudian difraksinasi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan air. Ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi dan dilusi. Metode difusi dengan konsentrasi 1%, 5%, 10%, 15%, 20% dan Metode dilusi konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,195% dan 0,098% terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi menunjukkan ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air daun pegagan dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan adanya daya hambat. Fraksi etil asetat 20% paling efektif karena memiliki rata-rata daya hambat paling besar yaitu 13,67 mm. Hasil uji metode dilusi menunjukkan nilai KBM fraksi etil asetat yaitu 12,5%. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat adalah fraksi teraktif. Kata kunci: Centella asiatica (L.) Urb, Antibakteri, Escherichia coli ATCC 25922