Objetivo: caracterizar as práticas de punção venosa periférica executadas pelos profissionais de enfermagem no cuidado aos pacientes pediátricos e geriátricos em um hospital universitário do sul do país. Método: quantitativo, observacional descritivo. Realizado em um hospital universitário da região sul do país, de dezembro de 2015 a junho de 2016, com 14 profissionais da equipe de enfermagem durante a realização da prática de punção venosa periférica em crianças e idosos. Resultados: Realizou-se 20 observações para o grupo de idosos e 5 para o grupo pediátrico, e em todas as observações houveram alguma divergência com a orientação teórica que poderia resultar em um dano ao paciente e/ou profissional. Conclusão: ao realizar esse estudo, percebeu-se uma variação da técnica e divergências entre as ações praticadas, destacando a importância da padronização e desenvolvimento de técnicas a partir de fundamentação científica para promoção da segurança do paciente.