As superfícies em ambientes de assistência a saúde são facilmente contaminadas. As medidas de desinfecção são essenciais para o controle de infecções. OBJETIVOS: Avaliar e comparar, in vitro, a ação antimicrobiana de desinfetantes de superfície sobre fungos e bactérias, utilizando o método de fricção. MATERIAIS E MÉTODOS: As superfícies de duas mesas foram desinfetadas com álcool 70%, sob fricção, divididas em 64 partes e contaminadas com suspensão microbiana padronizada de fungos e bactérias com turvação correspondente ao número 6 da escala de McFarland. Os desinfetantes testados foram: álcool 70% (A70), ácido peracético 0,2% (AP), dióxido de cloro 7% (DC) e cloreto de benzalcônio 5,2% com polihexametileno biguanida 3,5% (CBPB) que foram friccionados, durante 10 s nas áreas contaminadas. As amostras foram coletadas antes (controle positivo) e após a desinfecção, em triplicata, semeadas em meio de cultura e incubadas por 48 h a 37 ºC. RESULTADOS: O crescimento microbiano foi observado pela presença de unidades formadoras de colônias (UFC) no ágar. Candida albicans foi o microrganismo mais resistente aos produtos selecionados, com exceção do AP, que demonstrou ação contra todos os microrganismos testados. O CBPB foi o único desinfetante que não reduziu a formação de UFC. CONCLUSÃO: O AP obteve o melhor efeito antimicrobiano, sendo a opção mais segura para a desinfecção de alto nível. O A70 e o DC são indicados para a desinfecção intermediária. O CBPB não reduziu a formação das UFC, portanto não é indicado para protocolos de desinfecção.