O objetivo da pesquisa foi isolar e detectar o efeito antimicrobiano in vitro de bactérias ácido láticas (BAL) autóctones isoladas de leite cru, proveniente de Bom Jesus do Itabapoana/RJ-Brasil, contra Staphylococcus aureus ATCC 12600 e Escherichia coli ATTC 25922. As amostras de leite cru foram submetidas a contagem e isolamento, através da técnica de profundidade, em ágar MRS e M17. Os isolados de BAL foram confirmados após a realização da prova da catalase e coloração de Gram. A etapa de atividade antimicrobiana consistiu no teste de sobrecamada a partir do plaqueamento de superfície em ágar MRS e M17 e, por cima, o meio TSA com o patógeno inoculado. Foram analisadas 10 amostras, nas quais 55% dos resultados da contagem prevaleceram no 4 log UFC/mL. Das 95 cepas isoladas, 74 apresentaram características de BAL, e destes, 37 foram avaliados quanto à sua atividade antagônica sobre S. aureus e E. coli. Aproximadamente 76% dos isolados utilizados para teste de atividade antimicrobiana contra S. aureus e E.coli apresentaram ação inibitória contra pelo menos um dos patógenos testados. Ao que se tem conhecimento, esse é o primeiro estudo envolvendo cepas de BAL autóctones oriundas de leite da região Noroeste Fluminense.