As boas práticas para o uso seguro de medicamentos são direcionadas para a prevenção do erro de medicação no cuidado prestado ao recém-nascido por se tratar de uma população frágil e vulnerável. Objetivou-se analisar a existência de conformidades e não conformidades no preparo de antibiótico por enfermeiros em uma unidade de neonatologia. A pesquisa é do tipo transversal e descritiva de natureza observacional, desenvolvida com 12 enfermeiras de um hospital terciário. A coleta de dados aconteceu em janeiro de 2020 por meio de observação do preparo de medicação e dois formulários. O primeiro instrumento abordou dados do ambiente, do procedimento, rotulação correta e preparado do medicamento; o segundo coletou informações socioprofissionais. Os dados foram organizados no Excel e analisados pela estatística descritiva, com números inteiros, porcentagens, medidas da média e desvio padrão. Os resultados demonstraram que as enfermeiras apresentaram média de idade 37,83 anos; com 12,3 anos de formação acadêmica; 58,3% possuindo pós-graduação; 8,7 anos de experiência profissional, a maioria cooperados (75%). Quanto aos conhecimentos e práticas da equipe, viu-se a não utilização de prescrição, nem uso do rótulo de medicação; manipulação de forma incorreta; preparo com antecedência, mas houve conformidades com relação ao ambiente, a iluminação e ao uso de EPIs. Conclui-se que as não conformidades se sobressaem e nos levam a refletir sobre a atuação profissional do enfermeiro com vínculo empregatício frágil e no poder da gestão de interferir positivamente na promoção de um ambiente seguro, desencadeado por uma cultura de segurança institucionalizada.