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RESUMOO objetivo deste trabalho foi isolar identificar, rastrear enzimas de interesse biotecnológico, traçar o perfil de resistência a antimicrobianos e verificar a atividade antagonista de microrganismos termotolerantes isolados em aquífero termal em Caldas Novas, Brasil. Para tal foram coletadas amostras de águas profundas em três poços artesianos, inoculadas em ágar nutriente e incubadas a 37°C durante 24 horas. Os isolados foram identificados ao nível de espécie por espectrometria de massa MALDI-TOF. As espécies identificadas foram submetidas ao screening enzimático para amilase, celulase, gelatinase, caseinase, lipase e pectinase conforme metodologias padrão. O perfil de susceptibilidade das bactérias aos antimicrobianos foi realizado por disco difusão e a atividade antagonista foi avaliada frente à Escherichia coli ATCC 8739 e Staphilococcus aureus ATCC 25923. Foram obtidas quatro isolados identificados como Bacillus pumilus, Bacillus subtilis e dois Bacillus megaterium. Os isolados produziram caseinase e gelatinase e foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Bacillus pumilus, Bacillus subtilis e B. megaterium 3207 exibiram atividade antagonista frente ao S. aureus. A atividade antagonista frente à cepa de S. aureus aqui encontrada abre uma perspectiva para futuros estudos de identificação de metabólitos secundários com potencial atividade antimicrobiana