El presente estudio tuvo como objetivo principal, investigar la prevalencia de Rotavirus en niños menores de 5 años que presentaron un cuadro de diarrea aguda y que acudieron a dos laboratorios privados en el área central del departamento de Petén, durante octubre de 2010 a abril 2011. La muestra correspondió a 334 niños. El 54% de los niños eran hombres y el restante 46% mujeres, con una edad comprendida entre los 0 y 23 meses (79.3%), y 24 a 60 meses (20.7%); quienes provenían en su mayoría de los municipios de Flores, La Libertad y San Benito (69.15%). Se documentó que los niños presentaron fiebre y vómitos, aunados al cuadro de diarrea aguda en más del 70% de los casos con una media de 5±2 días de evolución. A estos niños se les realizó pruebas de Rotavirus en heces con ELISA (estándar relativo), inmunocromatografía y aglutinación en látex y se llenó un formulario con los datos proporcionados por los padres o cuidadores. La tasa de prevalencia de Rotavirus en niños que presentaron un cuadro agudo fue de 18%. No se observó asociación significativa para la proporción de casos de Rotavirus en función de la edad (p = 0.14), género (p = 0.23), presencia de vómitos (p = 0.19), fiebre (p = 0.23) y el tipo de alimentación (p = 0.31); ninguna de las variables estudiadas pudo considerarse como factor de riesgo. La prueba de inmunocromatografía presentó mejor desempeño que aglutinación por látex en relación a la sensibilidad (91.5% contra 67.8%). Ambas pruebas presentaron valores altos de especificidad (inmunocromatografía = 98.2%; aglutinación por látex = 97.3%) con relación a ELISA. En cuanto a la concordancia entre los métodos de detección en relación a ELISA, según los índices de Kappa calculados, la concordancia entre inmunocromatografía y ELISA fue muy buena (índice de Kappa = 0.84); y entre látex y ELISA fue buena (índice de Kappa = 0.63).