Media agar darah domba merupakan media standar untuk mengkultur bakteri pathogen, sebagai alternatifnya digunakan media agar darah manusia sisa transfusi.Penelitian ini bertujuan untuk mengamati perbedaan karakteristik bakteri Staphylococcus aureus pada media agar darah domba dan media agar darah manusia yang dilakukan di BBLK Palembang.Jenis penelitian ini dilakukan yaitu eksperimen dengan jumlah sampel sebanyak 32 dan dianalisa secara statistik. Suspensi bakteri yang berasal dari Strain murni bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923. Karakteristik koloni diamati secara makroskopis meliputi morfologi koloni, jumlah koloni dan diameter koloni.Nilai rata-rata jumlah koloni bakteri Staphylococcus aureus pada media agar darah domba dan media agar darah manusia sebanyak 173 dan 148 sedangkan diameter koloninya sebesar 2,5 mm dan 2 mm. Hasil data penelitian jumlah koloni di uji dengan uji T tidak berpasangan dengan hasil nilai p = 0,001 dan data diameter koloni di uji dengan uji alternativeMann Whitney dengan hasil nilai p = 0,031 yang artinya secara statistik ada perbedaan signifikan antara karakteristik koloni bakteri Staphylococcus aureus pada media agar darah domba dan media agar darah manusia.Kata kunci :Media agar darah domba, media agar darah manusia, Staphylococcus aureus.