No abstract

Protein kinase CK2 is a ubiquitous, highly pleiotropic, and constitutively active phosphotransferase that phosphorylates mainly serine and threonine residues. CK2 has been studied and characterized in many organisms, from yeast to mammals. The holoenzyme is generally composed of two catalytic (α and/or α') and two regulatory (β) subunits, forming a differently assembled tetramer. The free and catalytically active α/α' subunits can be present in cells under some circumstances. We present here the isolation of a putative catalytic CK2α subunit and holoenzyme from gills of the mussel Mytilus galloprovincialis capable of phosphorylating the purified recombinant ribosomal protein rMgP1. For further analysis of M. galloprovincialis protein kinase CK2, the cDNA molecules of CK2α and CK2β subunits were constructed and cloned into expression vectors, and the recombinant proteins were purified after expression in Escherichia coli. The recombinant MgCK2β subunit and MgP1 were phosphorylated by the purified recombinant MgCK2α subunit. The mussel enzyme presented features typical for CK2: affinity for GTP, inhibition by both heparin and ATP competitive inhibitors (TBBt, TBBz), and sensitivity towards NaCl. Predicted amino acid sequence comparison showed that the M. galloprovincialis MgCK2α and MgCK2β subunits have similar features to their mammalian orthologs.

Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών vii viii Πρόλογος Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε κατά το χρονικό διάστημα 2006 έως 2010 στον Τομέα Γενετικής και Βιοτεχνολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας Σοφίας Κουγιανού-Κουτσούκου, την οποία ευχαριστώ πρώτα από όλα για την εμπιστοσύνη με την οποία με τίμησε όλα αυτά τα χρόνια, καθώς και τη γενικότερη κατανόηση και καθοδήγηση. Η επιστημονική της κρίση υπήρξε καθοριστική για την Παπαντώνης, ο Δρ. Χρήστος Κοντός, ο Υποψήφιος Διδάκτωρ Πάνος Γιαννός, και οι Υποψήφιες Διδάκτορες Ιωάννα Χαλατσά και Ιωάννα Κοκκίνου. Η εργασία αυτή δε θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί αν δεν περνούσα πάρα πολλές ώρες στο εργαστήριο. Σε αυτά τα καθημερινά ξενύχτια συμπαραστάτες υπήρξαν πολλοί συνάδελφοί μου, των οποίων η παρότρυνση και ο ενθουσιασμός για την έρευνα με βοήθησαν να ξεπεράσω την οποιαδήποτε κούραση. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Δρ. Γιάννη Δρόσο για την βοήθειά του όλα αυτά τα χρόνια κατά τα οποία συνυπήρξαμε ως Υποψήφιοι Διδάκτορες του Τομέα Γενετικής και Βιοτεχνολογίας και που στις πιο δύσκολες στιγμές ήταν εκεί. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιά μου τον Λέκτορα Βασίλη Κουβέλη και τον Δρ. Αντώνη Κριμιτζά που όποτε χρειάστηκα την επιστημονική τους βοήθεια μου την προσέφεραν απλόχερα. Το τελευταίο χρονικό διάστημα της διατριβής μου είχα την χαρά να διευρύνω τους επιστημονικούς μου ορίζοντες σε χώρους που δεν είχα ασχοληθεί μέχρι σήμερα, και για αυτό ευχαριστώ τους Υπ. Διδάκτορες Θεοδώρα Κορομηλά και Γιάννη Παπαϊωάννου. Επίσης, θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω την Γραμματέα του Τομέα Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Αθηνά Μπούρμπουλα, που με αγκάλιασε και με βοήθησε με κάθε τρόπο σε ό,τι αφορά την γραφειοκρατία της Διατριβής μου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στους διπλωματικούς που με βοήθησαν στην ομαλή διεξαγωγή των πειραμάτων μου στο εργαστήριο και σε δύσκολες στιγμές με άντεξαν. Ευχαριστώ τη Μαρίνα Μακαρώνα, τη Μαρία Ανδρέου, το Σωτήρη Τασιγιώργο, την Ελένη Λασθιωτάκη, την Κωνσταντίνα Θανοπούλου, την Εβίτα Μανιατοπούλου, την Κατερίνα Τσικαλάκη, τον Απόστολο Λυράκο, το Θάνο Λαμπρόπουλο, το Θανάση Λέκκα και τη Μαρία Γουλιελμάκη. Η οικονομική υποστήριξη του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών για την υλοποίηση της διατριβής μου ήταν πολύ σημαντική. 2.1 Απομόνωση ολικού RNA από ιστό μυδιού M. galloprovincialis με τη χρήση του παράγοντα TRIzol (Invitrogen Cat No.15596-026)………………..……71 2.2 Απομόνωση ολικού RNA και mRNA από ιστό μυδιού M. galloprovincialis με κολώνες (Invitrogen Cat No. 12183-555)………………………………….……...71 2.3 Κατασκευή μορίων cDNA με αντίδραση RT-PCR με SuperScript III…….72 2.4 Απομόνωση χρωμοσωμικού DNA μικρής κλίμακας από ιστό μυδιού M. galloprovincialis κατά Holmes και Bonner (1973)………………………73 2.5 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με mini preps………………………..……74 2.6 Απομόνωση μικρής κλίμακας πλασμιδιακού DNA υψηλής Περιεχόμενα Κολαΐτη Ρεγγίνα-Μαρία 2 καθαρότητας κατά Iyer R………………………………………………………...........74 2.7 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων……………………………………..……75...