Интерес, проявляемый к НАД-зависимым гидрогеназам (КФ 1.12.1.2) обусловлен как теоретическими аспектами исследования полиядерных окислительно-восстановительных металлоферментов, так и возможностями их биотехнологического применения.В последнее время появляется все больше свидетельств тому, что одним из главных факторов, определяющих состояние ферментативной активности гидрогеназ, является окислительно-восстановительный потенциал среды [1][2][3][4][5][6]. Однако до сих пор изучение влияния редокс-потенциала на каталитические свойства НАД-зависимых ферментов этого класса носило лишь предварительный характер [7, 8].Целыо настоящей работы является выяснение связи между состоянием окисления электронтранспортной цепи растворимой HАД-зависимой гидрогеназы водородокисляющих бактерий Alcaligenes euirophus Zl и ее каталитическими свойствами.
Материалы и методы. Методика выделения и очистки фермента описана в [9].Чистоту фермента проверяли методом высокоэффективной жидкостной гель-фильтрации с использованием колонки ТСК-3000 (300X7,6 мм). Содержание примесей, которые были обусловлены высокомолекулярными агрегатами гидрогеназы, не превышало 5 %.Для редокс-титрования использовали электрохимическую анаэробную ячейку, описанную ранее [1]. Концентрация фермента в ячейке составляла ~8 мкМ. После уравновешивания раствора при определенном значении редокс-потенциала En из ячейки отбирали аликвоты объемом 40 мкл и вносили в спектрофотометрическую кювету (3 мл) для определения гидрогеназной (восстановление НАД водородом) или диафоразной (окисление НАДН 2,6-дихлорфенолиндофснолом) активностей (0,1 M К-фосфатный буфер, рН 7,8, 25 °С; концентрации НАД (H) -1 мМ, 2,6 дихлорфенолиндофенола -2 мМ). Измерение потенциала в ячейке проводили анаэробно в 0,5 M К-фосфатном буфере, рН 7,8, на платиновом электроде против насыщенного каломельного электрода в присутствии ряда переносчиков (2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленовый синий, резазурин, сафранин Т, бензилвиологен, метилвиологен; концентрация всех переносчиков-10 мкМ). Для титрования использовали растворы дитионита натрия и феррицианида калия. Активности измеряли в условиях насыщения по всем субстратам.Для изучения влияния редокс-потенциала среды на гидрогеназную активность с метилвиологеном (поглощение водорода в присутствии окисленной формы метилвиологена) был использован метод интегральных кинетических кривых. Реакции проводились в анаэробных кюветах и регистрировались спектрофотометрически (700 нм, 0,1 M К-фосфатный буфер, рН 7,8, 25 °С; концентрация метилвиологена -0,2-^2 мМ) по изменению концентрации восстановленной формы метилвиологена. По полученным таким образом интегральным кинетическим кривым находили значения скоростей реакций в различные моменты времени. Этим значениям скоростей ставили в соответствие рассчитанные в этих же точках интегральных кривых величины редокс-потенциала среды, которые вычисляли на основе уравнения Нернста, исходя из определенного спектрофотометрически соотношения концентраций окисленной и восстановленной форм метилвиологена. Для вычислений использовали коэф...
