Escherichia coli merupakan bakteri patogen penyebab diare yang dapat diatasi dengan pemberian antibiotik, tetapi penggunaan yang irasional menyebabkan terjadinya resistensi, sehingga perlu dicari antibakteri alternatif untuk mengatasinya. Biji pepaya diketahui mengandung senyawa fitokimia alkaloid, flavonoid, tanin, terpenoid, saponin, dan steroid yang berpotensi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak metanol 70% biji papaya terhadap E. coli dan konsentrasi ekstrak metanol 70% biji pepaya yang menunjukkan aktivitas antibakteri terbesar terhadap E. coli. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental laboratorium. Biji pepaya diekstraksi menggunakan metode maserasi, sedangkan metode skrining fitokimia dilakukan dengan uji tabung. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi Kirby-Bauer pada berbagai konsentrasi, yaitu 20%, 30%, 40%, dan 50% b/v dalam DMSO 10% dan ciprofloxacin 5 μg digunakan sebagai kontrol positif. Hasil uji skrining fitokimia ekstrak metanol 70% biji pepaya mengandung alkaloid, flavonoid, terpenoid, saponin, dan tanin. Semua konsentrasi uji ekstrak metanol 70% biji pepaya tidak menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap E. coli, sedangkan pada kontrol positif menunjukkan aktivitas antibakteri yang sangat kuat, yaitu sebesar 25,6 ± 0,92 mm. Berdasarkan hal tersebut, dapat diketahui ekstrak metanol 70% biji pepaya tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli.