To ensure appropriate metabolic regulation, riboswitches must discriminate efficiently between their target ligands and chemically similar molecules that are also present in the cell. A remarkable example of efficient ligand discrimination is a synthetic neomycin-sensing riboswitch. Paromomycin, which differs from neomycin only by the substitution of a single amino group with a hydroxy group, also binds but does not flip the riboswitch. Interestingly, the solution structures of the two riboswitch-ligand complexes are virtually identical. In this work, we demonstrate that the local loss of key intermolecular interactions at the substitution site is translated through a defined network of intramolecular interactions into global changes in RNA conformational dynamics. The remarkable specificity of this riboswitch is thus based on structural dynamics rather than static structural differences. In this respect, the neomycin riboswitch is a model for many of its natural counterparts.

The U-turn is a classical three-dimensional RNA folding motif first identified in the anticodon and T-loops of tRNAs. It also occurs frequently as a building block in other functional RNA structures in many different sequence and structural contexts. U-turns induce sharp changes in the direction of the RNA backbone and often conform to the 3-nt consensus sequence 5 ′ -UNR-3 ′ (N = any nucleotide, R = purine). The canonical U-turn motif is stabilized by a hydrogen bond between the N3 imino group of the U residue and the 3 ′ phosphate group of the R residue as well as a hydrogen bond between the 2 ′ -hydroxyl group of the uridine and the N7 nitrogen of the R residue. Here, we demonstrate that a protonated cytidine can functionally and structurally replace the uridine at the first position of the canonical U-turn motif in the apical loop of the neomycin riboswitch. Using NMR spectroscopy, we directly show that the N3 imino group of the protonated cytidine forms a hydrogen bond with the backbone phosphate 3′ from the third nucleotide of the U-turn analogously to the imino group of the uridine in the canonical motif. In addition, we compare the stability of the hydrogen bonds in the mutant U-turn motif to the wild type and describe the NMR signature of the C+-phosphate interaction. Our results have implications for the prediction of RNA structural motifs and suggest simple approaches for the experimental identification of hydrogen bonds between protonated C-imino groups and the phosphate backbone.

Synthetic riboswitches can serve as sophisticated genetic control devices in synthetic biology, regulating gene expression through direct RNA-ligand interactions. We analyzed a synthetic neomycin riboswitch, which folds into a stem loop structure with an internal loop important for ligand binding and regulation. It is closed by a terminal hexaloop containing a U-turn and a looped-out adenine. We investigated the relationship between sequence, structure, and biological activity in the terminal loop by saturating mutagenesis, ITC, and NMR. Mutants corresponding to the canonical U-turn fold retained biological activity. An improvement of stacking interactions in the U-turn led to an RNA element with slightly enhanced regulatory activity. For the first position of the U-turn motif and the looped out base, sequence-activity relationships that could not initially be explained on the basis of the structure of the aptamer-ligand complex were observed. However, NMR studies of these mutants revealed subtle relationships between structure and dynamics of the aptamer in its free or bound state and biological activity.

RNA-Schalter unterscheiden genau zwischen ihren eigentlichen Liganden und chemischä hnlichen Molekülen. Ein bemerkenswertes Beispiel für eine sehr hohe Ligandenspezifität ist ein synthetischer auf Neomycin reagierender RNA-Schalter.P aromomycin unterscheidet sich von Neomycin nur durch die Substitution einer Amino-durche ine Hydroxygruppe.E sb indet ebenfalls an den Neomycin-RNASchalter,s chaltet ihn aber nicht. Hier zeigen wir,d ass der Verlust einiger weniger wichtiger intermolekularer Wechselwirkungen an einer einzigen Position des ParomomycinKomplexes zu globalen ¾nderungen in der Konformationsdynamik der RNAf ührt. Außerdem identifizieren wir ein Netzwerk an intramolekularen Wechselwirkungen, über die der Verlust der lokalen intermolekularen Wechselwirkungen in entfernte Bereiche des Moleküls kommuniziert und in ¾nde-rungen der globalen Dynamik übersetzt wird. Daher beruht die Spezifität dieses RNA-Schalters auf Unterschieden in der strukturellen Dynamik und nicht auf statischen Strukturunterschieden.RNA-Schalter sind strukturierte RNA-Elemente,d ie insbesondere in den 5'-untranslatierten Bereichen bakterieller mRNAs vorkommen. Durch die spezifische Bindung an niedermolekulare Liganden regulieren sie die Genexpression auf der Ebene der Tr anskription, Tr anslation oder der RNAProzessierung.[1]RNA-Schalter sind Knotenpunkte der metabolischen Kontrolle der zellulären Homçostase von Koenzymen, Signalmolekülen, Protein-und Nukleinsäurebausteinen und Ionen. Um in der Zelle eine angemessene regulatorische Antwort sicherzustellen, müssen RNA-Schalter in der Lage sein, sehr genau zwischen ihren eigentlichen Liganden und chemisch ähnlichen Molekülen auch dann zu unterscheiden, wenn diese in hçheren Konzentrationen in der Zelle vorkommen oder wenn deren chemische Unterschiede zu den eigentlichen Liganden nur sehr gering sind.Für einige RNA-Schalter zeigen die Rçntgenkristall-strukturen ihrer Komplexe mit Liganden direkt, wie die Struktur der Ligandenbindetasche durch sterische Restriktionen dazu führt, dass auch chemisch oder strukturell sehr ähnlichen Ligandanaloga an der Bindung gehindert werden. [2] Für andere Fälle wurde aber gezeigt, dass sowohl die regulatorisch aktiven Liganden als auch deren regulatorisch inaktive Analoga in sehr ähnlicher Art und Weise an den RNASchalter binden und die Bildung sehr ähnlicher RNA-Tertiärstrukturen induzieren. [3] Hier untersuchen wir mit atomarer Auflçsung, wie der synthetische Neomycin-RNA-Schalter (Abbildung 1a)inder Lage ist, zwischen seinem eigentlichen Liganden und einem strukturell und chemisch sehr ähnlichen Analogon zu unterscheiden. [4] In der Hefe S. cerevisiae unterdrückt dieser RNA-Schalter in Anwesenheit der beiden verwandten Aminoglykoside Neomycin (NEO) und Ribostamycin (RIO) die Initiation der Tr anslation.[4] Dagegen ist er in Anwesenheit von Paromomycin (PAR;Abbildung 1b), das sich von NEO nur durch die Substitution einer Aminogruppe an Position 6' durch eine Hydroxygruppe unterscheidet (Abbildung 1c), regulatorisch inaktiv.I sotherme Titrationskalo...

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