This work involves the development and validation of an enzyme immunoassay technique (EIA) for the measurement of the cortisol concentration in cattle saliva. Saliva samples present several advantages over plasma samples in animal welfare studies. Saliva collection avoids venipuncture as a stress factor. Also, saliva components do not affect EIA as plasma components do. At present, there is no validated commercial method for saliva cortisol determination in cattle. Commercially available radioimmunoassay kits for human plasma (detection range: 10-100 ng ml -1 ) are not sensitive enough for animals with low concentrations of salivary cortisol (< 4 ng ml -1 ). Thus, EIA is the method of choice in cattle. Sensitivity, specificity, precision and accuracy EIA tests showed this method to be suitable and reliable. The detection limit was found to be 0.024 ng ml -1 , representing an improvement on previously described techniques. Intra-assay and inter-assay variation coefficients were 1.47-7.30% and 2.40-9.78%, respectively. The recovery rates for cortisol added to saliva samples were 91.36-126.5%. Parallelism tests showed that saliva cortisol levels can be determined in cattle samples without extraction. The correlation between saliva and plasma cortisol was positive (r = 0.75) and the saliva/plasma cortisol ratio was around 10%. Therefore, saliva samples are a suitable alternative to plasma samples in bovine HPA (hypothalamic-pituitary-adrenal) axis evaluation.Key words: immunoassay, HPA axis, cow, stress. ResumenValidación de una técnica de EIA para la determinación de cortisol en saliva de ganado bovino En este trabajo se desarrolla y valida una técnica de enzimoinmunoensayo (EIA) para la determinación directa de cortisol en muestras de saliva de ganado vacuno. La saliva como muestra tiene gran importancia en los estudios de bienestar animal, ya que presenta ventajas respecto al plasma, como son el menor estrés al que se somete a los animales para su obtención y la menor interferencia que producen los componentes de la saliva en la determinación directa en el EIA. Hoy en día no existe en el mercado ningún método validado para la determinación de cortisol en saliva en la especie bovina. Las técnicas de radioinmunoensayo comercializadas para plasma de la especie humana (rango de detección de 10 a 100 ng ml -1 ) no son suficientemente sensibles para el ganado bovino, que presenta concentraciones de cortisol salival muy reducidas (< 4 ng ml -1 ), por ello no es posible su adaptación para esta especie, siendo los métodos de EIA los de elección. El límite de detección de la técnica EIA fue de 0,024 ng ml -1 , mejorando la sensibilidad de técnicas descritas previamente; los coeficientes de variación intra e interensayo fueron de 1,47-7,30% y 2,40-9,78%, respectivamente. La recuperación de cortisol añadido a muestras de saliva fue de 91,36-126,5%. Las pruebas de paralelismo demostraron que es posible la determinación directa de muestras de saliva sin necesidad de extracción previa. La correlación existente entre las...