Resumo Introdução Modelos laboratoriais de biofilmes vêm sendo desenvolvidos com a finalidade de simular o ambiente bucal e o processo de formação da cárie dental. Objetivo Estabelecer e padronizar um modelo de biofilme in vitro para o desenvolvimento de lesões de cárie em dentina. Material e método Doze discos padronizados de dentina bovina foram divididos em três tempos experimentais: 4, 7 e 10 dias. As amostras de cada tempo experimental foram inoculadas com Streptococcus mutans UA 159 em meio de cultura BHI com 1% de sacarose e cultivadas em anaerobiose. As variáveis de resposta foram a perda de dureza integrada (ΔS) dos discos de dentina e dureza do substrato em diferentes profundidades. Os dados de ΔS foram analisados através de ANOVA seguido do teste Tukey, ambos com significância de 5%, e os dados de dureza de profundidade de lesão analisados descritivamente. Resultado Houve maior perda mineral aos 10 dias de crescimento microbiológico quando comparados aos 4 dias (p = 0,034), no entanto não houve diferença entre 7 e 10 dias (p = 0,853). O grupo de 4 dias mostrou perda de dureza em regiões mais superficiais (10-40µm); e o grupo de 10 dias mostrou desmineralização em áreas mais profundas, até 150 µm. Conclusão O modelo proposto mostrou-se capaz de desenvolver lesões de cárie artificiais em dentina. Em 7 dias, as lesões subsuperficiais de dentina foram adequadas para estudos de des-remineralização.