No abstract

No abstract

Background Loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) underlines much of the pathology of Parkinson’s disease (PD), but the existence of an endogenous neurogenic system that could be targeted as a therapeutic strategy has been controversial. BNN-20 is a synthetic, BDNF-mimicking, microneurotrophin that we previously showed to exhibit a pleiotropic neuroprotective effect on the dopaminergic neurons of the SNpc in the “weaver” mouse model of PD. Here, we assessed its potential effects on neurogenesis. Methods We quantified total numbers of dopaminergic neurons in the SNpc of wild-type and “weaver” mice, with or without administration of BNN-20, and we employed BrdU labelling and intracerebroventricular injections of DiI to evaluate the existence of dopaminergic neurogenesis in the SNpc and to assess the origin of newborn dopaminergic neurons. The in vivo experiments were complemented by in vitro proliferation/differentiation assays of adult neural stem cells (NSCs) isolated from the substantia nigra and the subependymal zone (SEZ) stem cell niche to further characterize the effects of BNN-20. Results Our analysis revealed the existence of a low-rate turnover of dopaminergic neurons in the normal SNpc and showed, using three independent lines of experiments (stereologic cell counts, BrdU and DiI tracing), that the administration of BNN-20 leads to increased neurogenesis in the SNpc and to partial reversal of dopaminergic cell loss. The newly born dopaminergic neurons, that are partially originated from the SEZ, follow the typical nigral maturation pathway, expressing the transcription factor FoxA2. Importantly, the pro-cytogenic effects of BNN-20 were very strong in the SNpc, but were absent in other brain areas such as the cortex or the stem cell niche of the hippocampus. Moreover, although the in vitro assays showed that BNN-20 enhances the differentiation of NSCs towards glia and neurons, its in vivo administration stimulated only neurogenesis. Conclusions Our results demonstrate the existence of a neurogenic system in the SNpc that can be manipulated in order to regenerate the depleted dopaminergic cell population in the “weaver” PD mouse model. Microneurotrophin BNN-20 emerges as an excellent candidate for future PD cell replacement therapies, due to its area-specific, pro-neurogenic effects.

No abstract

Οι νευροτροφικοί παράγοντες αποτελούν μερικούς από τους πλέον υποσχόμενους θεραπευτικούς υποψήφιους κατά της νόσου του Πάρκινσον (PD), αλλά η κλινική τους χρήση είναι περιορισμένη εξαιτίας της ανικανότητάς τους να διασχίσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB). Προηγούμενα αποτελέσματα της ομάδας μας, στο προκλινικό μοντέλο της PD μυ "weaver", υποδηλώνουν ότι η μικρομοριακή συνθετική νευροτροφίνη BNN-20 εμφανίζει πλειοτροπική νευροπροστατευτική δράση επί των ντοπαμινεργικών νευρώνων της SNpc του μυός «weaver», αναστέλλοντας σημαντικά τη νευροεκφύλιση, όταν η χορήγηση ξεκινά πριν την έναρξη της νευροεκφύλισης (Ρ0-Ρ20). Η νευροπροστατευτική του δράση ασκείται, χάρη στην ικανότητα του BNN-20 να ενεργοποιεί εκλεκτικά τον ειδικό υποδοχέα του BDNF ΤrkB, και τις καθοδικές σηματοδοτικές οδούς, TrkB-PI3K-Akt-NFκB και TrkB-ERK1/2-NFκB, δρώντας ως μιμητικό μόριο του BDNF, ενώ παράλληλα διαπερνά το BBB. Αρχικός σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί η νευροπροστατευτική επίδραση του ΒΝΝ-20 όταν η χορήγηση ξεκινά την Ρ14, όπου η νευροεκφύλιση έχει φτάσει το 40%, ομοιάζοντας την εξέλιξη της νόσου κατά την εκδήλωση των κινητικών συμπτωμάτων στον άνθρωπο. Στο πρώτο αυτό μέρος της παρούσας διατριβής παρατηρήθηκε ότι η χορήγηση BNN-20 τα διαστήματα Ρ14-Ρ40 και Ρ14-Ρ60, όχι μόνο αναστέλλει την περαιτέρω νευροεκφύλιση, αλλά και αυξάνει το συνολικό αριθμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων στην SNpc, υποδεικνύοντας την παρουσία ενήλικης ντοπαμινεργικής νευρογένεσης. Συνεπώς, δεύτερο στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε α) η επιβεβαίωση της ύπαρξης ενήλικης ντοπαμινεργικής νευρογένεσης στην SNpc, (η οποία ήταν μέχρι στιγμής αμφιλεγόμενη), β) η αξιολόγηση της επίδρασης της χρόνιας χορήγησης BNN-20 (P14-P60) στη νευρογένεση αυτή και γ) η προέλευση των νεογεννηθέντων νευρώνων της SNpc. Η παρουσία ενήλικης ντοπαμινεργικής νευρογένεσης αξιολογήθηκε in vivo με διπλή ανοσοφθορισμική χρώση έναντι του δείκτη πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων BrdU και του δείκτη ντοπαμινεργικών νευρώνων υδροξυλάση της τυροσίνης (ΤΗ), στην SNpc άγριου-τύπου και «weaver» μυών την Ρ60, μετά από καθημερινή χορήγηση BNN-20 (Ρ14-Ρ60) και 5-βρωμο-2'-δεοξυουριδίνης (BrdU) (Ρ40-Ρ60 ή Ρ20-Ρ40). Επιπρόσθετα, η νευρογενετική ικανότητα της μέλαινας ουσίας (SN), καθώς και η νευρογενετική δράση του ΒΝΝ-20 μελετήθηκε περαιτέρω, μέσω απομόνωσης και καλλιέργειας ενήλικών νευρικών βλαστικών κυττάρων (NSCs) από την SN και την υποεπενδυματική ζώνη των πλάγιων κοιλιών (SEZ) in vitro.ΤΤα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι στην SNpc άγριου τύπου (Ρ60) υπάρχει χαμηλός βασικός ρυθμός ενήλικης ντοπαμινεργικής νευρογένεσης, ο οποίος αυξάνεται σημαντικά στους μύες «weaver», πιθανώς ως αντισταθμιστικός μηχανισμός. Η χρόνια χορήγηση BNN-20 οδήγησε σε περαιτέρω, δραματική αύξηση του ρυθμού ντοπαμινεργικής νευρογένεσης στην SNpc, γεγονός που υποδηλώνει τη νευρογενετική του δράση. Τα παραπάνω είναι συνεπή με τα in vitro αποτελέσματα, όπου λίγες πρωτογενείς νευρόσφαιρες αναπτύχθηκαν από την SN μυών αγρίου-τύπου, ενώ σημαντικά περισσότερες αναπτύχθηκαν από την SN «weaver» μυών. Τόσο η χρόνια χορήγηση BNN-20, όσο και η απευθείας προσθήκη ΒΝΝ-20 στο θρεπτικό υλικό, φαίνεται ότι δρα κυρίως προάγοντας τη διαφοροποίησή των NSCs σε νευρώνες και νευρογλοία, και, λιγότερο, επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό τους.Επιπρόσθετα, η νευρογενετική δράση του ΒΝΝ-20 εμφανίζεται ιστοειδική, αφού δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στη νευρογένεση στις κύριες νευρογενετικές ζώνες του εγκεφάλου (υποκοκκιώδης στιβάδα της οδοντωτής έλικας του ιπποκάμπου - SGZ και SEZ) μετά τη χορήγηση του BNN-20. Τέλος, πειράματα σήμανσης των NSCs της SEZ, με τη στερεοταξική έγχυση της λιπόφιλης χρωστικής DiI στις πλάγιες κοιλίες αγρίου-τύπου και «weaver» μυών, υποδεικνύουν ότι οι νεογεννηθέντες νευρώνες της SNpc, προέρχονται, τουλάχιστον εν μέρει από τα NSCs της SEZ. Τα παραπάνω αναδεικνύουν το ΒΝΝ-20 ως ένα πολλά υποσχόμενο μικρομοριακό παράγοντα που θα μπορεί δυνητικά, όχι μόνο να αναστείλει, αλλά και να αναστρέψει την εξέλιξη της PD.