α-Synuclein (α-syn) has been genetically and biochemically linked to the pathogenesis of Parkinson's disease (PD). There is accumulating evidence that misfolded α-syn species spread between cells in a prion-like manner and seed the aggregation of endogenous protein in the recipient cells. Exosomes have been proposed to mediate the transfer of misfolded α-syn and thus facilitate disease transmission, although the pathological mechanism remains elusive. Here, we investigated the seeding capacity of exosomeassociated α-syn, in vivo. Disease-associated α-syn was present in exosome fractions isolated from transgenic A53T mouse brain. However, following intrastriatal injection of such exosomes in wild-type (wt) mice, we were not able to detect any accumulation of endogenous α-syn. In addition, recombinant fibrillar α-syn, when loaded to isolated brain exosomes, induced minor pathological α-syn brain accumulation at 7 months post injection. These data suggest that exosomes neutralize the effect of toxic α-syn species and raise additional questions on their paracrine modulatory role in disease transmission.

The model biological organisms Drosophila melanogaster and Drosophila virilis have been utilized to assess effects on apoptotic cell death of follicles during oogenesis and reproductive capacity (fecundity) decline. A total of 280 different experiments were performed using newly emerged flies exposed for short time daily for 3-7 d to various EMF sources including: GSM 900/1800 MHz mobile phone, 1880-1900 MHz DECT wireless base, DECT wireless handset, mobile phone-DECT handset combination, 2.44 GHz wireless network (Wi-Fi), 2.44 GHz blue tooth, 92.8 MHz FM generator, 27.15 MHz baby monitor, 900 MHz CW RF generator and microwave oven's 2.44 GHz RF and magnetic field components. Mobile phone was used as a reference exposure system for evaluating factors considered very important in dosimetry extending our published work with D. melanogaster to the insect D. virilis. Distance from the emitting source, the exposure duration and the repeatability were examined. All EMF sources used created statistically significant effects regarding fecundity and cell death-apoptosis induction, even at very low intensity levels (0.3 V/m blue tooth radiation), well below ICNIRP's guidelines, suggesting that Drosophila oogenesis system is suitable to be used as a biomarker for exploring potential EMF bioactivity. Also, there is no linear cumulative effect when increasing the duration of exposure or using one EMF source after the other (i.e. mobile phone and DECT handset) at the specific conditions used. The role of the average versus the peak E-field values as measured by spectrum analyzers on the final effects is discussed.

Several lines of evidence indicate that the propagation of misfolded α‐synuclein (α‐syn) plays a central role in the progression and manifestation of Parkinson's disease. Pathogenic α‐syn species can be present in the extracellular space. Thus, the identification and modulation of the key enzymes implicated in extracellular α‐syn turnover becomes vital. Kallikrein peptidase 6 has been identified as one of the major α‐syn degrading enzymes and has been implicated in the clearance of extracellular α‐syn. However, the physiological role of this enzyme in regulating α‐syn, in vivo, still remains elusive. Here, by utilizing Klk6 knock‐out (Klk6−/−) mice as our experimental model, we provide insight into the physiologic relevance of endogenous KLK6 expression on α‐syn processing. Behavioral phenotyping showed that Klk6−/− mice display no gross behavioral abnormalities. Further in vivo characterization of this mouse model, in the context of α‐syn accumulation, showed that KLK6 deletion had no impact on the protein levels of intracellular or extracellular α‐syn. Upon in vivo administration of α‐syn pre‐formed fibrils (PFF), α‐syn pathologic accumulations were evident both in the brains of Klk6−/−mice and wt mice without significant differences. Intrastriatal delivery of active KLK6, did not affect secreted α‐syn levels observed in the A53T α‐syn over‐expressing mice. These findings suggest that in the in vivo setting of PFF pathology induction, KLK6 alone is not able to modulate pathology transmission. Our study raises implications for the use of recombinant α‐syn fibrils in α‐syn turnover studies.

Εισαγωγικά στοιχεία: Η νόσος του Πάρκινσον αποτελεί μια από τις συχνότερες νευροεκφυλιστικές παθήσεις η οποία χαρακτηρίζεται από προοδευτικά εξελισσόμενη εκφύλιση του κεντρικού νευρικού συστήματος με τελικό αποτέλεσμα τη σταδιακή έκπτωση της κινητικότητας του ατόμου. Μέχρι και σήμερα δεν έχει ανακαλυφθεί η αιτία της νόσου και κατά επέκταση ούτε κάποια αιτιολογική θεραπεία. Ωστόσο, συνδυασμός γενετικών και βιοχημικών δεδομένων υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη αποτελεί βασικό παθογενετικό αίτιο της νόσου. Σημαντική για την τοξική δράση της α-συνουκλεΐνης έχει θεωρηθεί η τάση της πρωτεΐνης αυτής να δημιουργεί ολιγομερή, που σχηματίζουν διαλυτά πρωτοϊνίδια, τα οποία σταδιακά αρχίζουν να συσσωρεύονται στο κυτταρόπλασμα και να σχηματίζουν μη διαλυτά συσσωματώματα. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχει εστιάσει στην ικανότητα της δια-κυτταρικής μεταφοράς των ινιδίων της α-συνουκλεΐνης ως έναν από τους βασικούς μηχανισμούς επαγωγής της παθολογίας. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών υποστηρίζουν ότι οι ινώδεις μορφές της ανασυνδυασμένης α-συνουκλεΐνης φαίνεται να μοιράζονται κάποια κοινά χαρακτηριστικά με τις πρωτεΐνες prion. Πιο συγκεκριμένα, τα ινίδια α-συνουκλεΐνης μπορούν να εκκριθούν στον εξωκυττάριο χώρο, να προσληφθούν από γειτονικά κύτταρα και να επάγουν τον πολυμερισμό/συσσωμάτωση της ενδοκυττάριας μονομερούς α-συνουκλεΐνης στα κύτταρα-δέκτες, επιταχύνοντας με αυτό τον τρόπο την μετάδοση/εξέλιξη της παθολογίας της νόσου σταδιακά σε ολόκληρο τον εγκέφαλο σε in vivo μοντέλα. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω δεδομένα, είναι προφανές ότι ο έλεγχος των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης εξωκυττάρια είναι πιθανό να αντιπροσωπεύει έναν καθοριστικό στόχο για τη διατήρηση της ομοιόστασης του νευρικού κυττάρου. Για το λόγο αυτό, το μονοπάτι καταβολισμού/επεξεργασίας της α-συνουκλεΐνης έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Η καλλικρεΐνη 6 (KLK6) είναι μια εξωκυττάρια σερινοπρωτεάση τύπου-θρυψίνης, η οποία παράγεται σε υψηλά επίπεδα στο νευρικό σύστημα και εκκρίνεται στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση της KLK6 σχετίζεται ανάστροφα με τη συσσώρευση α-συνουκλεΐνης σε εγκεφάλους ασθενών με Άνοια με Σωμάτια Lewy, ενώ η υπερέκφραση της Klk6 ποντικού μέσω τροποποιημένων λεντιιών σε διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν την αγρίου-τύπου (wt) α-συνουκλεΐνη οδηγεί σε μείωση των ενδοκυττάριων και νευροπιληκών συσσωματωμάτων αποτελούμενων από α-συνουκλεΐνη. Επιπρόσθετα, σε ένα μοντέλο διαγονιδιακών ποντικών, πρότυπο για τη μελέτη ατροφίας πολλαπλών συστημάτων, βρέθηκε ότι η εκκρινόμενη στον εξωκυττάριο χώρο α-συνουκλεΐνη φαίνεται να ευθύνεται για την ανάπτυξη παθολογίας σε αυτό το ζωικό μοντέλο και ότι η ενδοπεριτονιακή χορήγηση του τροποποιημένου ενζύμου KLK6 για ειδική στόχευση στον εγκέφαλο έχει ως αποτέλεσμα την βελτίωση της παθολογίας τους. Στόχος της ερευνητικής εργασίας: Βασισμένοι σε πρόσφατα δημοσιευμένα αποτελέσματά μας, σύμφωνα με τα οποία είχε δειχθεί ότι οι ανασυνδυασμένες μορφές της α-συνουκλεΐνης και οι φυσιολογικά εκκρινόμενες μορφές αυτής υπόκεινται σε διαφορική πρωτεολυτική πέψη από τηνKLK6, θελήσαμε στην παρούσα μελέτη να διευκρινίσουμε τον φυσιολογικό ρόλο της πρωτεάσης KLK6 στον καταβολισμό της φυσιολογικά εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης. Συνολικά, στόχος της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη του ενζύμου KLK6 ως φυσιολογικού ρυθμιστή του καταβολισμού τόσο της εξωκυττάριας όσο και των ινωδών μορφών α-συνουκλεΐνης και κατά επέκταση της μετάδοσης της παθολογίας της νόσου in vivo. Αποτελέσματα: Αρχικά, εφαρμόζοντας in vitro πειραματικές προσεγγίσεις σε κυτταρικά μοντέλα επιβεβαιώσαμε ότι η φυσιολογικά εκκρινόμενη α-συνουκλεΐνη υφίσταται πρωτεολυτική πέψη από την KLK6, ενώ παράλληλα δείξαμε ότι η KLK6 μπορεί να αποικοδομήσει ινώδεις μορφές ανασυνδυασμένης α-συνουκλεΐνης, οι οποίες έχουν βρεθεί να εμπλέκονται στην έναρξη και εξέλιξη της νόσου του Πάρκινσον με μηχανισμούς παρόμοιους με αυτούς των πρωτεϊνών prion. Εν συνεχεία, προκειμένου να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω in vitro αποτελέσματα μας σε πιο παθοφυσιολογικά συστήματα και να προσδιορίσουμε κατά πόσο τα επίπεδα της KLK6 αποτελούν κρίσιμο παράγοντα για την τροποποίηση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης σε in vivo πλέον συνθήκες, αναπτύξαμε ένα νέο ζωικό πρότυπο(knockout) το οποίο αφορά σε ποντίκια με αδρανοποιημένο το γονίδιο Klk6 (Klk6-/-). Για την πλήρη μελέτη του νέου αυτού ζωικού μοντέλου πραγματοποιήσαμε λεπτομερή φαινοτυπική ανάλυση των Klk6-/- ποντικών, η οποία περιελάμβανε τον συμπεριφορικό αλλά και τον βιοχημικό χαρακτηρισμό τους. Πρώτα, έλαβαν χώρα μια σειρά από συμπεριφορικές δοκιμές σε wt και Klk6-/- ποντίκια με σκοπό την αξιολόγηση τόσο των κινητικών όσο και των γνωστικών λειτουργιών τους. Οι δοκιμές για τη μελέτη τυχόν κινητικών δυσλειτουργιών περιελάμβαναν το τεστ αυθόρμητης κινητικής δραστηριότητας σε ανοικτό πεδίο, το τεστ της περιστρεφόμενης ράβδου, τη δοκιμή δοκού, το τεστ πιασίματος λαβής και την ανάλυση αποτυπώματος,ενώ οι γνωστικές συμπεριφορικές δοκιμές περιελάμβαναν τον Υ-λαβύρινθο και το τεστ αναγνώρισης νέων αντικειμένων και νέας τοποθεσίας μέσω όσφρησης. Για τις παραπάνω δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν τουλάχιστον 10 ποντίκια ίδιου φύλου ανά ομάδα και πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια ηλικίας 3 και 12 μηνών με σκοπό να εντοπίσουμετυχόν εκφυλισμένες γνωστικές ή κινητικές δραστηριότητες που σχετίζονται με την γήρανση όπως συμβαίνει και με την νόσο του Πάρκινσον. Συνολικά, οι αναλύσεις έδειξαν ότι τα Klk6-/- ποντίκια είναι εμφανώς υγιή και αναπαράγονται φυσιολογικά,ενώ συμπεριφορικά φέρονται παρόμοια με τα wt ποντίκια σε όλες τις παραπάνω δοκιμές με μοναδική εξαίρεση ότι ασκούν λιγότερη δύναμη στη δοκιμή πιασίματος λαβής στην ηλικία των 12 μηνών. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με κινητικά προβλήματα τα οποία ανακαλούν κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Πάρκινσον.Στη συνέχεια, με βιοχημικές αναλύσεις προσδιορίσαμε τα ενδογενή επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στα Klk6-/- ποντίκια. Χρησιμοποιώντας εξειδικευμένα πρωτόκολλα απομονώσαμε τόσο τις διαλυτές όσο και τις αδιάλυτες μορφές της ενδοκυττάριας α-συνουκλεΐνης από περιοχές του εγκεφάλου Klk6-/- και wt ποντικών που σχετίζονται παθολογοανατομικά με την νοσό του Πάρκινσον (εγκεφαλικός φλοιός, μεσεγκέφαλος και ραβδωτό σώμα). Ακολούθως, τα ενδοκυττάρια επίπεδα α-συνουκλεΐνης αναλύθηκαν με ανασοαποτύπωση κατά Western σε διάφορα ηλικιακά στάδια,ξεκινώντας από ποντίκια νεαρής ηλικίας (1 και 3 μηνών) και συνεχίζοντας με ενήλικα (6 και 9 μηνών) και γηρασμένα (13 και 18 μηνών). Ωστόσο, η σύγκριση των ενδοκυττάριων επιπέδων α-συνουκλεΐνης σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια δεν έδειξε καμία διαφορά ανάμεσα στους εγκεφάλους Klk6-/- και wt ποντικών. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης στο ενδιάμεσο υγρό (ISF, interstitial fluid) των εγκεφάλων Klk6-/- και wt ποντικών ηλικίας 12 μηνών χρησιμοποιώντας την τεχνική της in vivo μικροδιαπίδυσης, μέσω της οποίας είναι δυνατή η απομόνωση του ενδιάμεσου υγρού από εγκεφάλους ζωντανών ποντικών. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της εξωκυττάριας α-συνουκλεΐνης, ο οποίος έγινε με μια ανοσοχημική μέθοδο υψηλής ευαισθησίας τύπου ELISA εδραιωμένη στο εργαστήριο μας ειδικά για την ανίχνευση α-συνουκλεΐνης σε βιολογικά υγρά, έδειξε ότι τα Klk6-/- ποντίκια εμφανίζουν παρόμοια επίπεδα με αυτά των wt στο ενδιάμεσο υγρό των εγκεφάλων τους. Αφού εξετάσαμε το πώς η έλλειψη της πρωτεάσης KLK6 επηρεάζει τα ενδογενή επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στον εγκέφαλο των ποντικών, προχωρήσαμε στον προσδιορισμό του ρόλου της KLK6 στην παθολογική εξέλιξη της νόσου. Για το σκοπό αυτό, χορηγήσαμε εξωγενώς σε πρωτογενείς καλλιέργειες φλοιϊκών νευρώνων,προερχόμενες είτε από Klk6-/- ή wt ποντίκια, ινώδεις μορφές ανασυνδυασμένης α-συνουκλεΐνης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι μορφές αυτές ενδοκυτταρώνονται από τα νευρικά κύτταρα και διενεργούν τοξικές δράσεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε το εύρημα μας ότι απουσία της KLK6, οι τοξικές αυτές μορφές α-συνουκλεΐνης ενδοκυτταρώνονται σε μεγαλύτερο βαθμό από νευρωνικές καλλιέργειες Klk6-/- ποντικών σε σύγκριση με τις wt.Το επόμενο βήμα μας ήταν η χορήγηση των ινωδών μορφών ανασυνδυασμένης α-συνουκλεΐνης σε Klk6-/- και wt ποντίκια με στόχο τη μελέτη της μετάδοσης της παθολογίας απουσία της KLK6 σε in vivo συνθήκες. Οι ενέσεις των τοξικών ινιδίων α-συνουκλεΐνης πραγματοποιήθηκαν στο ραβδωτό σώμα των Klk6-/- και wt ποντικών(Ν=4 ανά ομάδα, 5 μg ινίδια) με στερεοτακτική έγχυση. Δύο μήνες μετά την έγχυση τα ζώα θυσιάστηκαν και ο βαθμός της μετάδοσης της παθολογίας μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημικές χρώσεις τομών εγκεφάλου για ολική και φωσφορυλιωμένη α-συνουκλεΐνη, που αποτελεί δείκτη της παθολογικής α-συνουκλεΐνης. Σε αντίθεση με τα in vitro αποτελέσματα μας, παρατηρήσαμε ότι στο in vivo μοντέλο μας η απουσία του ενζύμου KLK6 δεν επιτάχυνε ούτε διευκόλυνε τη μετάδοση των ινιδίων της α-συνουκλεΐνης καθώς ο ρυθμός και η έκταση ανάπτυξης συσσωματωμάτων παθολογικής φωσφορυλιωμένης α-συνουκλεΐνης ήταν παρόμοιος ανάμεσα στα Klk6-/-και wt ποντίκια. Τέλος, για να σχηματίσουμε μια πλήρη εικόνα σχετικά με τη δράση της KLK6 στον καταβολισμό της α-συνουκλεΐνης και κατά συνέπεια στην κάθαρση των παθολογικών μορφών της πρωτεΐνης αυτής, χορηγήσαμε στο ραβδωτό σώμα των εγκεφάλων ποντικών που υπερεκφράζουν μια μεταλλαγμένη παθολογική μορφή α-συνουκλεΐνης (A53T διαγονιδιακά ποντίκια), το ένζυμο KLK6. Η χορήγηση πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ανάστροφης in vivo μικροδιαπίδυσης και εν συνεχεία εξετάσαμε τα επίπεδα της εξωκυττάριας A53T α-συνουκλεΐνης στο ενδιάμεσο υγρό των A53T εγκεφάλων πριν και μετά την έγχυση του ενζύμου. Με την ανοσοχημική μέθοδο υψηλής ευαισθησίας τύπου ELISA ποσοτικοποιήσαμε τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης μετά την χορήγηση KLK6 τα οποία βρέθηκαν να είναι παρόμοια με αυτά πριν την έγχυση. Συμπεράσματα: Συνολικά, η μελέτη αυτή έχει συμβάλλει σε μεγάλο βαθμό στο να διευκρινιστεί ο φυσιολογικός ρόλος του ενζύμου KLK6 στον καταβολισμό της α-συνουκλεΐνης και στην εξέλιξη της παθολογίας στη νόσο του Πάρκινσον. Παρόλο που τα in vitro αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τόσο η φυσιολογικά εκκρινόμενη α-συνουκλεΐνη όσο και οι τοξικές ινώδεις μορφές αυτής υφίστανται πρωτεολυτική πέψη από την KLK6, οι in vivo αναλύσεις μας αποκάλυψαν ότι το ένζυμο αυτό δεν αντιπροσωπεύει αναπόσπαστο παράγοντα ρύθμισης των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης. Πιο συγκεκριμένα, υπό φυσιολογικές συνθήκες, όπως στο Klk6-/- in vivo μοντέλο της παρούσας μελέτης, είναι πιθανό ότι άλλα μονοπάτια καταβολισμού/επεξεργασίας της α-συνουκλεΐνης μπορεί να αναπληρώνουν την απουσία της δράσης της KLK6, διατηρώντας με αυτόν τον τρόπο την α-συνουκλεΐνη σε φυσιολογικά επίπεδα. Η επιστημονική κοινότητα έχει στρέψει το ενδιαφέρον της προς την πρωτεάση KLK6 ως πιθανό μόριο-στόχο για καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις στη νόσο Πάρκινσον. Ωστόσο, είναι άκρως απαραίτητο μελλοντικές ερευνητικές προσπάθειες να εστιάσουν στην φαρμακολογική αξιοποίηση της KLK6 με στόχο να αυξηθεί η κάθαρση των παθολογικών μορφών της α-συνουκλεΐνης και να ανασταλεί η μολυσματικότητα της πρωτεΐνης υπό φυσιολογικές συνθήκες.