ΥΛΙΚΑ 43 ΟΡΓΑΝΑ 43 ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 44 3.1 Παρασκευή φωσφορυλάσης b. 44 3J2 Παρασκευή φωσφορυλάσης a 44 33 Παρασκευή φωσφορυλάσης b' 44 3.4 Παρασκευή αποφωσφορυλάσης 45 3 J) Ανασύσταση της αποφωσφορυλάσης με 5*-οΊφωσφορική πνρώοξάλη (PLPP) 45 3.6 Ανάπτυξη μονοκλινών κρυστάλλων φωσφορυλάσης b 45 3.7Ανάπτυξη μικροκρυστάλλων φωσφορυλάσης a και b 47 ΑΝΑΑΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 47 3.8 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας σε διάλυμα 47 3.9 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας σε μυφοκρυστάλλους 3.10 Επεξεργασία κινητικών δεδομένων 3.11 Μέτρηση πρωτεϊνικής συγκέντρωσης 3.12 Υπερφνγοκέντρηση 3.13 Φασματοσκοπία EPR. 3.14 Συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων 3.15 Ανάλυση κρυσταλλογραφικών δεδομένων 3.16 Βελτίωση (refìnement) της πρωτεϊνικής δομής 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 64 4.1 Η ενεργοποίηση της φωσφορυλάσης b από το θειικό αμμώνιο 4.1.1 Κινητικές μελέτες 4.1.2 Μελέτες EPR 4.13 Μελέτες υπερφυγοκέντρησης 4.2 Επίδραση του θειικού αμμωνίου στη φωσφορυλάση b' 43 Μελέτες στην τετραμερή μορφή της φωσφορυλάσης b 43.1 Ιδιότητες τετραμερούς φωσφορυλάσης b στο διάλυμα 43.2 Κινητικές ιδιότητες κρυσταλλικής φωσφορυλάσης b και a 82 433 Επίδραση του θειικού αμμωνίου στην ενεργοποίηση της διμερούς φωσφορυλάσης b από ολχγοσακχαρίτες 86 4.4 Μελέτη του καταλυτικού μηχανισμού της φωσφορυλάσης. Κρυσταλλογραφική μελέτη της φωσφορυλάσης b με συνένζυμο την y-δκρωσφορική πυριδοξάλη (PLPP) στη θέση του φυσικού συνενζύμου, S-φωσφορικής πυριδοξάλης (PLP) 87 4.4.1 Η δομή της ΡΕΡΡφοσφορυλάσης 88 4.42 Η δομή της S -δΊφωσφορικής πυριδοξάλης 91 4.43 Σύγκριση της δομής της PLPP-GPb με την Τ διαμόρφωση 95 4.4.4 Η θέση της δεύτερης φωσφορικής ομάδας της PLPP 96