ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο καρκίνος του στόματος αποτελεί μία από τις συχνότερες μορφές καρκίνου παγκοσμίως, αντιστοιχώντας σε 380.000 νέες περιπτώσεις ετησίως, μεταξύ των οποίων το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος (ΑΚΣ) αντιπροσωπεύει τη συντριπτική πλειοψηφία. Παρά τις εξελίξεις στις μεθόδους θεραπευτικής αντιμετώπισης, το ΑΚΣ εξακολουθεί να εμφανίζει σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα με ποσοστά 5ετούς επιβίωσης που δεν υπερβαίνουν το 50%.Είναι γνωστό ότι ένα σημαντικό ποσοστό των ΑΚΣ αναπτύσσεται στο έδαφος μίας προκαρκινικής βλάβης ή κατάστασης με πιο συχνή τη λευκοπλακία. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, ο κλινικός όρος λευκοπλακία αναφέρεται σε μία "λευκή πλάκα στον βλεννογόνο του στόματος που δεν αποκολλάται από το επιθήλιο στο οποίο αναπτύσσεται, αμφιβόλου κινδύνου κακοήθους εξαλλαγής, αφού αποκλειστούν άλλα γνωστά νοσήματα ή διαταραχές που δεν σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου". Η λευκοπλακία του στόματος εμφανίζει επιπολασμό 4,11% παγκοσμίως, ενώ το ποσοστό κακοήθους εξαλλαγής κυμαίνεται μεταξύ 0,13% και 34%, με ετήσια επίπτωση 1-3%. Συνεπώς, η έγκαιρη διάγνωση και αντιμετώπιση των προκαρκινικών βλαβών μπορεί να αναχαιτίσει την εξέλιξη των βλαβών και να συμβάλλει στην αποφυγή της κακοήθους εξαλλαγής.Μέχρι σήμερα, διάφορες μελέτες έχουν επιχειρήσει να προσδιορίσουν μία σειρά κλινικών, ιστολογικών και μοριακών χαρακτηριστικών που θα επιτρέψουν τον αδρό προσδιορισμό βλαβών με υψηλό κίνδυνο κακοήθους εξαλλαγής. Διάφοροι κοινωνικο-δημογραφικοί παράγοντες (μεγαλύτερη ηλικία, γυναικείο φύλο, μη καπνιστές), κλινικά χαρακτηριστικά (μεγαλύτερο μέγεθος, μη ομοιογενής εμφάνιση και εντόπιση σε περιοχές υψηλού κινδύνου, όπως τα πλάγια χείλη της γλώσσας και το έδαφος του στόματος), καθώς και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά (υψηλότερος βαθμός δυσπλασίας) έχουν δειχθεί να σχετίζονται με τον κίνδυνο κακοήθους εξαλλαγής. Επιπλέον, ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στη χρησιμότητα μοριακών δεικτών για την πρόβλεψη κακοήθους εξαλλαγής μιας προκαρκινικής βλάβης. Εντούτοις, δεν έχουν ακόμα διευκρινιστεί ακριβείς παράμετροι και μέθοδοι προσδιορισμού τους που επιτρέπουν με αξιοπιστία τον ακριβή καθορισμό του δυναμικού εξαλλαγής μιας βλάβης σε κακοήθεια, γεγονός που καθιστά απαραίτητη την περαιτέρω μελέτη των λευκοπλακιών, κυρίως σε μοριακό και βιολογικό επίπεδο. Οι περισσότερες μελέτες, βέβαια, έχουν συσχετίσει τα χαρακτηριστικά εκείνα που προβλέπουν την κακοήθη εξαλλαγή των βλαβών, ενώ είναι πολύ λίγες εκείνες που έχουν επικεντρωθεί στον προσδιορισμό των παραμέτρων που θα μπορούσαν να προσδιορίσουν τον κίνδυνο υποτροπής, μετά την αφαίρεση της αρχικής βλάβης. Εντούτοις, οι υποτροπές των λευκοπλακιών, οι οποίες μερικές φορές μπορεί να είναι και περισσότερες της μίας στην ίδια θέση, θεωρούνται συχνές με συχνότητα 5ετούς εμφάνισης σε ποσοστό σχεδόν 50% και υποδηλώνουν επιμονή των βλαβών με συνακόλουθη αυξημένη τάση εξαλλαγής τους. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν διιστάμενες απόψεις ως προς το αν η αντιμετώπιση της λευκοπλακίας θα πρέπει να επικεντρώνεται στην επεμβατική θεραπεία ή στη συστηματική και μακροχρόνια παρακολούθηση των βλαβών. Κατά κύριο λόγο όμως προτείνεται η αφαίρεση/εξάλειψη της βλάβης, ενώ οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι περιλαμβάνουν τη χειρουργική αφαίρεση με νυστέρι ή την εξαίρεση ή εξάχνωση με laser. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν:•Η συγκριτική αξιολόγηση των επιδημιολογικών, κλινικών και ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών των λευκοπλακιών με στόχο την ανίχνευση προβλεπτικών δεικτών υποτροπής.•Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση επιλεγμένων μοριακών δεικτών (pSΤΑΤ3, Bcl-xL, survivin, κυκλίνη D1 και Ki-67) που σχετίζονται με την ογκογόνο σηματοδοτική οδό του επαγωγέα σήματος και ενεργοποιητή της μεταγραφάσης 3 (SΤΑΤ3) και εμπλέκονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Επίσης, η συσχέτιση της έκφρασής τους με τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των βλαβών και η εκτίμηση της προβλεπτικής αξίας τους όσον αφορά τον κίνδυνο υποτροπής των βλαβών•Η σύγκριση των προαναφερθέντων κλινικών, μικροσκοπικών και ανοσοϊστοχημικών χαρακτηριστικών μεταξύ των αρχικών βλαβών και των αντίστοιχων υποτροπών τους.ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΣ: Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 33 ασθενείς με κλινική διάγνωση λευκοπλακίας από το Αρχείο της Κλινικής Στοματολογίας και Νοσοκομειακής Οδοντιατρικής της Οδοντιατρικής Σχολής Αθηνών, κατά το χρονικό διάστημα Ιανουάριος 2010 – Μάρτιος 2020. Όλοι οι ασθενείς είχαν υποβληθεί είτε σε ολική βιοψία-εξαίρεση με νυστέρι (βλάβες < 1 εκ.) ή σε αρχική μερική βιοψία (βλάβες > 1 εκ.) και στη συνέχεια εξάχνωση της υπολειμματικής βλάβης με CO2 laser. Το βιοπτικό υλικό είχε αποσταλεί για ιστοπαθολογική εξέταση με διάγνωση επιθηλιακής υπερπλασίας ή επιθηλιακής δυσπλασίας ήπιου, μέτριου ή έντονου βαθμού.Τα κριτήρια ένταξης στη μελέτη περιελάμβαναν τη διαθεσιμότητα δημογραφικών δεδομένων, όπως ηλικία, φύλο, συνήθειες καπνίσματος και κατανάλωσης αλκοόλ και πλήρες ιατρικό ιστορικό, λεπτομερείς κλινικές πληροφορίες, συμπεριλαμβα¬νομένου του αριθμού, της θέσης, του μεγέθους και της κλινικής εμφάνισης (ομοιογενείς έναντι μη-ομοιογενείς βλάβες), βιοψία (ολική ή μερική) και ιστοπαθολογική διάγνωση με διαθεσιμότητα ιστών για περαιτέρω διερεύνηση και παρακολούθηση των ασθενών για τουλάχιστον 1 έτος.Κριτήρια αποκλεισμού αποτέλεσαν η διάγνωση ΑΚ κεφαλής και τραχήλου σε χρονικό διάστημα μικρότερο των 18 μηνών πριν από την πρώτη επίσκεψη και το ιστορικό προηγούμενης χημειοθεραπείας ή ακτινοθεραπείας. Λευκές μη αποκολ¬λώμενες βλάβες συμβατές με υπερκερατίνωση λόγω τριβής ή άλλες διαγνώσεις (διαφορετικές από τη λευκοπλακία) αποκλείστηκαν επίσης από τη μελέτη.Από τα ιστορικά των ασθενών και τα παραπεμπτικά των ιστολογικών εξετάσεων αξιολογήθηκαν τα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά, οι καπνιστικές συνήθειες και η κατανάλωση αλκοόλ, η κλινική εικόνα, η εντόπιση των βλαβών, καθώς και το μέγεθος. Οι ιστολογικές τομές όλων των βλαβών επαναξιολογήθηκαν από δύο ιστοπαθολόγους για την επιβεβαίωση της ιστολογικής διάγνωσης και τον καθορισμό της θετικότητας ή μη των ορίων. Η καταγραφή των κλινικών και ιστολογικών χαρακτηριστικών αφορούσε τόσο στις αρχικές βλάβες κατά την πρώτη επίσκεψη ή κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης όσο και στις υποτροπές.Εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος της σημασμένης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης υπεροξειδάσης σε 3 στάδια με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των μορίων: phospho-STAT3 (rabbit monoclonal Tyr705) (CST, D3A7, #9145) (1:200), Survivin (CST, 71G4B7, #2808) (1:300), Cyclin D1 (CST, E3P5S, #55506) (1:300), Ki-67 (CST, D2H10, #9027)(1:250) και Bcl-xL (CST, 54H6, #2764) (1:200) (Cell Signaling Technology, Leiden, The Netherlands). Η ανοσοϊστοχημική χρώση αξιολογήθηκε σε 5 επιλεγμένα πεδία (μεγέθυνση x400), κάθε ένα από τα οποία περιελάμβανε τουλάχιστον 100 κύτταρα. Η χρώση θεωρήθηκε θετική όταν τα κύτταρα εμφάνιζαν πυρηνική χρώση και καταγράφηκε η εντόπισή τους στη βασική, στις υπερβασικές και στην ακανθωτή στιβάδα. Η ανοσοϊστοχημική χρώση βαθμολογήθηκε ημιποσοτικά με κριτήριο την ένταση της χρώσης ως: (0) απουσία χρώσης, (1) ήπια, (2) μέτρια, ή (3) έντονη και την εντόπιση των θετικών κυττάρων ως: (0) < 1%; (1) 1-25%; (2) 26-50%; (3) >50%. Το τελικό σκορ προέκυψε από το άθροισμα των επιμέρους σκορ έντασης (0-3) και ποσοστού θετικότητας των κυττάρων (0-3) για κάθε περίπτωση. Όλες οι περιπτώσεις φωτογραφήθηκαν με τη χρήση του WSI software program (Microvisioneer, Germany) σε μικροσκόπιο Olympus CX 23 microscope. Η συγκριτική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε ως εξής:•Οι αρχικές βλάβες που υποτροπίασαν συγκρίθηκαν με εκείνες που δεν υποτρο¬πίασαν με βάση τα δημογραφικά δεδομένα και τις συνήθειες των ασθενών (ηλικία, φύλο, κάπνισμα και χρήση αλκοόλ), τα κλινικά χαρακτηριστικά (εντόπιση, μέγεθος, ομοιογένεια ή όχι) και τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά (επιθηλιακή υπερπλασία έναντι διαφόρων βαθμών δυσπλασίας). •Τα ανοσοϊστοχημικά σκορ των πέντε μορίων που διερευνήθηκαν συγκρίθηκαν μεταξύ των αρχικών βλαβών που υποτροπίασαν και εκείνων που δεν υποτροπίασαν, ενώ επίσης συσχετίστηκαν με την παρουσία ή τον βαθμό δυσπλασίας των διαφόρων βλαβών•Για βλάβες που εμφάνισαν υποτροπή, όλες οι παραπάνω παράμετροι συγκρίθηκαν επίσης μεταξύ των αρχικών βλαβών και των αντίστοιχων υποτροπών τους.Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για τις διάφορες παρατηρήσεις / μετρήσεις με όριο στατιστικής σημαντικότητας τιμή P < 0.05 και τη χρήση του στατιστικού προγράμματος SPSS software application (version 21.0: SPSS, Chicago, IL, U.S.A.). Τα αρχικά χαρακτηριστικά εκφράστηκαν ως απόλυτη (n) και σχετική συχνότητα (%) και τα στοιχεία συγκρίθηκαν με το two tailed Fisher’s exact test. Η στατιστική σύγκριση των ανοσοϊστοχημικών τιμών πραγματοποιήθηκε με τη στατιστική δοκιμασία Mann-Whitney U test, ενώ για τις καμπύλες ελεύθερης νόσου επιβίωσης εφαρμόστηκε η μέθοδος Kaplan and Meier. Η προγνωστική σημασία όλων των παραμέτρων αναλύθηκε με το προγνωστικό μοντέλο Cox proportional hazards model.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Σε σύνολο 33 ασθενών καταγράφηκαν συνολικά 135 βλάβες με ιστοπαθολογική διάγνωση επιθηλιακής υπερπλασίας ή δυσπλασίας. Από αυτές 97 καταγράφηκαν ως αρχικές βλάβες (63 κατά την πρώτη επίσκεψη και 34 κατά την παρακολούθηση) και 38 ως υποτροπές (24 κατά την πρώτη επίσκεψη και 14 κατά την παρακολούθηση). Ως υποτροπές, θεωρήθηκαν οι βλάβες που αναπτύχθηκαν στην ίδια εντόπιση και θέση με την αρχική βλάβη. Όσον αφορά τις αρχικές βλάβες (97) των ασθενών, η πιο συχνή εντόπιση ήταν ο παρειακός βλεννογόνος (33%), το μέσος μέγεθος των βλαβών ήταν 1.4 (± 0,7), από αυτές το 73.2% ήταν ομοιογενείς και το 62.9% ιστολογικά διαγνώστηκαν ως ήπιου βαθμού δυσπλασία. Από τις 97 αρχικές βλάβες 31 (32%) υποτροπίασαν τουλάχιστον μία φορά, ενώ καμία από αυτές δεν υπέστη κακοήθη εξαλλαγή. Εντούτοις, μία μόνο περίπτωση ανάπτυξης ΑΚΣ καταγράφηκε κατά την περίοδο παρακολούθησης των ασθενών, σε διαφορετική όμως εντόπιση (έδαφος στόματος) από την αρχική βλάβη (αριστερή παρειά) του ασθενούς. Η πιο συχνή εντόπιση των υποτροπών (38 βλάβες) ήταν ο παρειακός βλεννογόνος (31.6%), το μέσο μέγεθος των βλαβών ήταν 0.9 (± 0.4), 84.2% ήταν ομοιογενείς, ενώ 50% εξ αυτών διαγνώστηκαν ιστολογικά ως ήπιου βαθμού δυσπλασία και 28.9% ως υπερπλασία. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις αρχικές βλάβες που υποτροπίασαν και εκείνες που δεν υποτροπίασαν όσον αφορά τις διάφορες επιδημιολογικές παραμέτρους (φύλο, ηλικία), τις συνήθειες καπνίσματος και αλκοόλ, τα κλινικά (εντόπιση, μέγεθος, ομοιογένεια) και ιστολογικά χαρακτηριστικά (παρουσία και βαθμός δυσπλασίας). Ωστόσο, περισσότερες υποτροπές παρατηρήθηκαν μεταξύ των μη ομοιογενών βλαβών (p=0.087) και μεταξύ των δυσπλασιών σε σχέση με τις υπερπλασίες (34.5% vs. 15.4%). Όσον αφορά την έκφραση των ανοσοϊστοχημικών δεικτών, ανάμεσα στις αρχικές βλάβες (97) που υποτροπίασαν και εκείνες που δεν υποτροπίασαν, τα μόρια Bcl-xL και survivin παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης στις βλάβες που υποτροπίασαν σε σύγκριση με αυτές που δεν υποτροπίασαν και προσδιορίστηκαν ως σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για υποτροπή της λευκοπλακίας, σύμφωνα με τη μονοπαραγοντική ανάλυση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε μόνο την έκφραση του μορίου Bcl-xL ως παράγοντα κινδύνου υποτροπής. Επίσης, στη σύγκριση των 31 αρχικών βλαβών και των αντίστοιχων υποτροπών τους, φάνηκε ότι οι υποτροπές ήταν όλες μικρού μεγέθους (έναντι 64,5% των αρχικών βλαβών) και στη πλειοψηφία τους ομοιογενείς (87,1%, έναντι 61,3% των αρχικών βλαβών), με στατιστική σημαντικότητα p<0.001 και p=0.040, αντίστοιχα. Όσον αφορά τις μικροσκοπικές παραμέτρους, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.028), καθώς οι υποτροπές διαγνώστηκαν συχνότερα ως υπερπλασίες (32,3%) σε σχέση με τις αντίστοιχες αρχικές βλάβες (6,5%). Όσον αφορά τους ανοσοϊστοχημικούς δείκτες, τα μόρια pSTAT3 και Bcl-xL είχαν στατιστικά σημαντική υψηλότερη έκφραση στις υποτροπές συγκριτικά με τις αρχικές βλάβες για την ένταση της χρώσης, το ποσοστό έκφρασης και το συνολικό σκορ. Αντίστοιχα, η ένταση της χρώσης για το μόριο survivin και το συνολικό σκορ για την Cyclin D1 προσέγγισαν τη στατιστική σημαντικότητα (p=0.059 και p=0.070, αντίστοιχα). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Στη μελέτη αυτή αξιολογήθηκαν τα επιδημιολογικά, κλινικά, μικροσκοπικά και ανοσοϊστοχημικά χαρακτηριστικά σε συσχέτιση με την υποτροπή των λευκοπλακιών. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι διάφορες παράμετροι που μπορεί να σχετίζονται με την υποτροπή ενδέχεται να διαφέρουν σε μεγάλο βαθμό από εκείνους που σχετίζονται με τον κίνδυνο κακοήθους εξαλλαγής. Επίσης, η διαφορετική έκφραση κάποιων μορίων μπορεί να συσχετίζεται διαφορετικά με την πιθανότητα υποτροπής σε σχέση με την κακοήθη εξαλλαγή. Επίσης, παρά το γεγονός ότι οι υποτροπές είχαν ηπιότερα κλινικο-ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά (όπως υψηλότερα ποσοστά μικρού μεγέθους, ομοιογένειας και απουσίας δυσπλασίας) σε σχέση με τις αρχικές τους βλάβες, κάποιοι μοριακοί δείκτες (pSTAT3 και Bcl-xL) παρουσίασαν μεγαλύτερη έκφραση στις υποτροπές, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει αυξημένο επίπεδο μοριακών διαταραχών, πιθανώς συνδεδεμένο με τον κίνδυνο περαιτέρω εξέλιξης. Συνεπώς, η συχνή παρακολούθηση θα μπορούσε να οδηγήσει σε έγκαιρη ανίχνευση αυτών των βλαβών προτού οι μοριακές παρεκκλίσεις οδηγήσουν σε επιθετικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Σε συνδυασμό με το γεγονός ότι καμία από τις αρχικές βλάβες δεν υπέστη κακοήθη εξαλλαγή, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι συχνές επανεξετάσεις των ασθενών, η στενή παρακολούθηση, καθώς και η έγκαιρη ανίχνευση και αποτελεσματική αντιμετώπιση των νέων βλαβών συμβάλλουν στην αποφυγή κακοήθους εξαλλαγής. Το τελευταίο ιδιαίτερα εύρημα θα μπορούσε να υποστηρίξει ένα προτεινόμενο πρωτόκολλο αντιμετώπισης προκαρκινικών βλαβών που να συμπεριλαμβάνει την πλήρη αφαίρεση αυτών είτε με νυστέρι είτε με εξάχνωση με laser, καθώς και τη στενή παρακολούθηση των ασθενών επί μακρόν και ανά τακτά χρονικά διαστήματα.