Резюме. Белок CRM197 является нетоксичным производным дифтерийного токсина и характеризуется одной мутацией, а именно, заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52. Белок CRM197 является перспективным адъювантом нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных и терапевтических препаратах. Классическим способом получения дифтерийного токсина и его нетоксичных производных является продукция в клетках Corynebacterium diphtheriae. Преимущество использования E. coli в качестве продуцента состоит в том, что данный метод является более простым и дешевым, и позволяет получать рекомбинантный CRM197 в короткие сроки с использованием непатогенного микроорганизма. В данной работе использовался запатентованный высокопродуктивный штамм-продуцент рекомбинантного CRM197 на основе клеток E. coli. В ходе исследования подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гена crm197, разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного CRM197 путем последовательного применения ионообменной, гидрофобной и молекулярноситовой типов хроматографии.

No abstract

Адрес для переписки:Духовлинов Илья Владимирович ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России 197110, Россия, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7. Тел.: 8 (981) 881-82-01. E-mail: dukhovlinov@gmail Medicine and Biology 197110, Russian Federation, St. Petersburg, Pudozhskaya str., 7. Phone: 7 (981) 881-82-01. E-mail: dukhovlinov@gmail.com FliCVP6VP8» // Медицинская иммунология, 2016. Т. 18, № 5. С. 417-424. doi: 10.15789/1563-0625-2016-5-417-424 © Духовлинов И.В. и соавт., 2016 For citation: I.V. Dukhovlinov, E.G. Bogomolova, E.A. Fedorova, A.S. Simbirtsev "Protective activity study of a candidate vaccine against rotavirus infection based on recombinant protein FliCVP6VP8", Medical Immunology (Russia) /Meditsinskaya Immunologiya, 2016, Vol. 18, no. 5, pp. 417-424. doi: 10.15789/1563-0625-2016 DOI: http://dx.doi.org/10. 15789/1563-0625-2016-5-417-424 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КАНДИДАТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА FliCVP6VP8Духовлинов И.В., Богомолова Е.Г., Федорова Е.А., Симбирцев А.С. ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, РоссияРезюме. Ротавирусы являются одной из ведущих причин возникновения тяжелой диареи, приво-дящей к дегидратации организма у детей младшего возраста. Большинство детей инфицируется до до-стижения 5-летнего возраста. В России заболеваемость ротавирусной инфекцией постоянно растет, что объясняется как увеличением числа случаев инфицирования, так и совершенствованием спосо-бов диагностики данного заболевания. Иммунитет к ротавирусной инфекции нестойкий, поэтому заболевание может повторяться в течение жизни. Невосприимчивость у переболевших обусловлена формированием не только IgM-и IgG-, но и IgA-специфичных антител. На данный момент на ми-ровом рынке отсутствуют препараты с прямым противоротавирусным действием, ввиду этого самым эффективным способом борьбы с данным заболеванием считается своевременная вакцинация. Суще-ствующие в настоящее время вакцины для профилактики ротавирусной инфекции основаны на жи-вых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, которые размножаются в кишечнике человека. Использование вакцин на основе рекомбинантных белков по-зволяет избежать рисков, связанных с введением вируса в организм, пусть и аттенуированного. В дан-ной работе изучали протективную активность кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции. Активный агент кандидатной вакцины -белок FliCVP6VP8 -включает фрагмент белка VP6, фраг-мент белка VP8 ротавируса А, а также компоненты флагеллина Salmonella typhimurium FliC в качестве адъюванта, компоненты соединены гибкими мостиками. Целью данного исследования было изучение эффективности кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного FliCVP6VP8 на модели ротавирусной инфекции на лабораторных мышах линии Balb/c. Был показан высокий уровень защиты, возникающий при двукратном внутримышечном введени...

Rotaviruses are the most frequent cause of children enteritis. This infection often leads to severe dehydration of organism. Many infectious diseases are accompanied by fluid loss being the most common cause of death. Nowadays an early vaccination is considered to be the most effective way for prevention of rotavirus infection. However attenuated alive vaccines are used for this purpose which can result in different complications. The candidate vaccine presented in this study was designed on the basis of recombinant fusion proteins-the crucial active agents for development of immune response against rotaviruses. As part of the study the following steps were taken: the design of fusion proteins VP6VP8 and FliCVP6VP8; protocol adjustment for induction of genes encoding these proteins expression, which yields in high level of the protein with minor expenditures; production and purification of recombinant proteins VP6VP8 and FliCVP6VP8 with metal affinity chromatography.

The aim of research: to synthesize the gene, coding the non-toxic variant of diphtheria toxin CRM197, to explore its expression in Escherichia coli cells, to construct bacterial strain - producer of recombinant CRM197 and to develop the method for purification of this CRM197 protein from the biomass of bacteria. Materials and methods of research. the gene of CRM197 was synthesized by chemical and enzymatic methods. Expression vector pColdII-CRM197 construction and assembly were performed by standard genetic engineering methods. CRM197 production by Escherichia coli cells was explored by electrophoresis in polyacrylamide gel and immunoblotting. The recombinant CRM197 was purified with the use of metal-chelate chromatography. Results. The application of the pColdII expression vector made possible to produce recombinant protein after decrease of the cell cultivation temperature from 37° C to 16° C. The method for purification of CRM197 recombinant protein was developed and the protein preparation with the purity 97% was obtained, having molecular mass 60 kDa; this protein was coupled with polyclonal antibodies against diphtheria toxin in the immunoblot. Conclusion. Successful production of CRM197 recombinant protein was reached with the use of pColdII vector at the decreased cell cultivation temperature. The purified CRM197 demonstrated nuclease activity pointing its proper folding. Production of the purified recombinant CRM197 protein allows its use for development of new conjugate vaccines.