No abstract

A method of atomic force microscopy-based fishing (AFM fishing) has been developed for protein detection in the analyte solution using a chip with an immobilized aptamer. This method is based on the biospecific fishing of a target protein from a bulk solution onto the small AFM chip area with the immobilized aptamer to this protein used as the molecular probe. Such aptamer-based approach allows to increase an AFM image contrast compared to the antibody-based approach. Mass spectrometry analysis used after the biospecific fishing to identify the target protein on the AFM chip has proved complex formation. Use of the AFM chip with the immobilized aptamer avoids interference of the antibody and target protein peaks in a mass spectrum.

No abstract

1 Учреждение российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии РАМН имени В.Н. Ореховича РАМН, Москва, 119121, ул. Погодинская, 10; тел.: (7)(095)2463761; факс: (7)(095)

Цель исследования: обнаружение маркера гепатита С - ядерного белка HCVcoreAg с помощью нанопроводного детектора на основе структур «кремний-на-изоляторе» (КНИ-НП) с р-типом проводимости, модифицированной антителами. Методика: были использованы КНИ-структуры с p-типом проводимости. Толщина отсеченного слоя кремния составляла 32 нм, скрытого окисла (buried oxide, BOX) - 300 нм. В экспериментах ширина сенсоров составляла w = 3 мкм, толщина t = 32 нм, длина l = 10 мкм, число нанопроводов на кристалле 12. Поверхность нанопроводов (НП) модифицировалась в парах аминопропилтриэтоксисилана (APTES). Антитела против HCVcoreAg были ковалентно иммобилизованы на модифицированную НП-поверхность с использованием кросс-линкера дитиобис (сульфосукцинимидил пропионата) (DTSSP). В измерениях была использована жидкостная кювета объемом 500 мкл, дном которой являлся кристалл с НП-структурами. Диаметр чувствительной зоны составлял ~2 мм. Перемешивание раствора в кювете осуществлялось с помощью мешалки при скорости 3000 об./мин. Электрические измерения проводились с помощью пикоамперметра фирмы Keithley (model 6487, Keithley, http://www.keithley.com). Результаты: для НП-биосенсора с КНИ-НП p-типа с иммобилизованными антителами показана возможность регистрации HCVcoreAg в нейтральном и кислом буферных растворах. Минимальная концентрация HCVcoreAg, при которой был обнаружен белок, составила 10М. Заключение: Показано, что с помощью биосенсора на базе нанопроводов p-типа с иммобилизованными антителами может быть обнаружен в растворе биомаркер вирусного гепатита С без использования меток, в режиме реального времени. Концентрационная чувствительность анализа составила порядка 10 М. Aim. To detect HCVcoreAg using a nanowire detector based on silicon-on-insulator structures (SOI-NW) with p-type conductivity with immobilized antibodies. Methods. Silicon-on-insulator (SOI) structures with p-type conductivity were used. The cut-off layer thickness was 32 nm; the buried oxide (BOX) layer thickness was 300 nm. In the experiments, the sensor width was w = 3 mm, the thickness was t = 32 nm, the length was l = 10 mm, and the number of nanowires (NWs) on the crystal was 12. The surface of NWs was modified in aminopropyltriethoxysilane (APTES) vapor. Antibodies against HCVcoreAg were covalently immobilized onto the modified NW surface using a dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP) crosslinker. Throughout the measurements, a measuring cell (500 mL volume), whose bottom was a crystal with NW structures, was used. The diameter of sensor area was ~2 mm. The solution in the cell was stirred at 3000 rpm. Electrical measurements were conducted using a Keithley picoampermeter. Results. The study demonstrated that the NW biosensor with p-type SOI-NWs with immobilized antibodies was capable for detecting HCVcoreAg in buffer solutions with neutral and acidic pH. The lowest HCVcoreAg concentration, at which the protein was detectable, was 10 М. Conclusion. The viral hepatitis C biomarker can be detected in solutions in real time using a biosensor based on p-type NWs with immobilized antibodies, without using labels. The concentration sensitivity of the analysis was of the order of 10 M.