Os microrganismos cavernícolas, principalmente os de litologia ferrífera, são pouco conhecidos. Estes constituem a maior parte da biodiversidade da caverna e desempenham papel fundamental na manutenção do ecossistema cavernícola. O isolamento e a caracterização da microbiota cavernícola podem levar a identificação de novas espécies e a obtenção de substâncias de interesse biotecnológico. O objetivo desse trabalho foi isolar e avaliar as atividades enzimática e antimicrobiana de microrganismos isolados do solo de caverna do Parque Nacional dos Campos Ferruginosos, sudeste amazônico. Foram coletadas amostras de solos da camada superficial interna da caverna GEM-1462 nas diferentes zonas (afótica, disfótica e fótica). Para caracterização das linhagens, utilizou-se a técnica de coloração de Gram e prova bioquímica. Foram avaliadas as atividades proteolíticas, celulolítica, amilolítica, fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato e actinomicetos dos microrganismos. A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio de ensaio de antibiose, teste de difusão em disco e concentração inibitória mínima contra cepas bacterianas padrão. No total, foram isoladas 10 colônias microbianas distintas e todas apresentaram atividade enzimática, destacando-se a atividade proteolítica. Quatro linhagens microbianas apresentaram atividade antimicrobiana para as cepas Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniae. Este estudo demonstrou a primeira descoberta de atividade biológica dos microrganismos de caverna ferrífera, indicando que a caverna GEM-1462 é uma promissora fonte para prospecção de microrganismos com potencial biotecnológico, principalmente de enzimas proteolíticas.